啤酒廢酵母中粗蛋白質(zhì)的提取工藝研究

啤酒廢酵母中粗蛋白質(zhì)的提取工藝研究

啤酒報廢牛奶是啤酒生產(chǎn)過程中最重要的副產(chǎn)品。每100噸啤酒，約1.5.2萬噸濕啤酒，干式發(fā)酵母（8%10%）約0.35.0噸。啤酒酵母中含蛋白質(zhì)約50%,其氨基酸組成接近理想蛋白質(zhì)的水平,尤其是谷物中所缺乏的賴氨酸在啤酒酵母中含量極為豐富。利用質(zhì)優(yōu)價廉的啤酒廢酵母資源提取蛋白質(zhì),既可以作為食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)強化劑,同時經(jīng)過適當(dāng)酶解處理還可得到具有一定生理活性的多肽產(chǎn)品。目前,從酵母細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的方法主要有:化學(xué)處理法、機械破壁法、自溶破壁法和酶解自溶法?；瘜W(xué)處理法通常會引起蛋白質(zhì)的變性;機械破壁法能耗較大,相應(yīng)其效率較低;細(xì)胞自溶法所需反應(yīng)時間較長,而蛋白質(zhì)提取率不高。有研究表明,適當(dāng)添加促溶劑有利于提高酵母細(xì)胞抽提率。采用多種方法相結(jié)合提取蛋白質(zhì)的研究則很少有報道。作為評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的一項重要指標(biāo),蛋白質(zhì)消化率的測定有體內(nèi)法和體外法。體內(nèi)法能夠較好的反映動物實際消化情況,但因受到條件制約且操作比較復(fù)雜,許多學(xué)者用體外消化法來代替。體外法中以胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法在單胃動物體外消化模擬研究中應(yīng)用最多,測定的蛋白質(zhì)消化率的結(jié)果最接近體內(nèi)消化法。本研究以誘導(dǎo)劑+自溶法為基礎(chǔ),結(jié)合機械破壁和酶解法,通過對比實驗優(yōu)選適宜的較高蛋白質(zhì)得率的破壁方法,并對酵母蛋白提取的工藝條件進行優(yōu)化,同時采用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法,首次測定啤酒酵母蛋白質(zhì)粗提物的體外消化率。1材料和方法1.1生化酶的測定啤酒廢酵母(已初步除雜并干燥處理)南昌亞洲啤酒有限公司。β-葡聚糖酶(≥6000.0U/g)、1398中性蛋白酶(≥50000.0U/g)、胰蛋白酶(≥2500.0U/g)和胃蛋白酶(≥1200.0U/g)國藥集團化學(xué)試劑有限公司;小蘇打、食鹽、苯甲酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、2%硼酸溶液、混合指示液(0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液以1:5混合)均為分析純。1.2n-4c數(shù)控消化爐TDL-5-A型離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;KDN-04C數(shù)控消化爐上海精隆科學(xué)儀器有限公司;KSY-9820凱氏定氮儀廈門精藝興業(yè)科技有限公司;TDL-5-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器鞏義市英峪予華儀器廠等。1.3方法1.3.1破乳、澄清、破碎工藝流程:干啤酒廢酵母→粉碎→過篩除雜→離心分離→脫苦、脫臭→離心分離取100g廢啤酒酵母,粉碎過80目的篩子,除去廢酵母中的可見雜質(zhì)。加入1000ml蒸餾水,攪拌均勻,將酵母懸浮液在5000r/min下離心10min。沉淀再加入0.5%小蘇打溶液1000ml,攪拌,靜置作用1h脫苦、脫臭。最后以轉(zhuǎn)速5000r/min,離心分離10min,即得預(yù)處理的酵母泥。1.3.2酵母泥的制備通過對比實驗以確定最佳的啤酒酵母破壁方法。方法1:膠體磨+誘導(dǎo)劑+自溶法預(yù)處理酵母泥用膠體磨進行機械破壁處理后,取20g,加3倍體積的水和3%的食鹽,攪拌均勻,并同時加入0.5g苯甲酸鈉,用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值到5.0,于55℃水浴鍋中保溫24h。方法2:誘導(dǎo)劑+自溶+酶解法取預(yù)處理酵母泥20g,同方法1自溶12h后,加入中性蛋白酶20U/g干酵母,β-葡聚糖酶10U/g干酵母,酶解12h。方法3:膠體磨+誘導(dǎo)劑+自溶+酶解法預(yù)處理酵母泥經(jīng)膠體磨機械破壁后,取20g,進行同對比方法2的處理。1.3.3蛋白質(zhì)粗提物的制備工藝流程:自溶破壁后→加熱滅酶→離心分離→真空濃縮→干燥分別取以上三種破壁方法所得處理液,5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min,收集上清液。適量水洗滌器底沉淀物,離心分離收集第二次、第三次提取液。合并上清液,即得蛋白質(zhì)提取液。將所得蛋白質(zhì)提取液真空濃縮至一定體積,再真空干燥得蛋白質(zhì)粗提物。濃縮和干燥過程中,溫度保持在50℃到55℃之間,以防止蛋白質(zhì)變性。1.3.4多因素正交試驗設(shè)計為確定蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件,選取酶解溫度、時間、pH值、加酶量,設(shè)計四因素三水平L9(34)正交試驗,以總氮收率(含氮量采用凱氏定氮法測定)為指標(biāo),試驗設(shè)計如表1所示。1.3.5微生物指標(biāo)檢測將30ml溶有胃蛋白酶的HCl-KCl緩沖液(pH1.4)加入樣品中,37±0.1℃下消化3h;用0.2mol/LNaOH調(diào)節(jié)其pH值至6.8,量取30mlKH2PO4-NaOH緩沖液(pH6.8)加入樣品中,再移取1.5ml溶有胰蛋白酶的KH2PO4-NaOH緩沖液于樣品中,37±0.1℃下振蕩培養(yǎng)3h,消化完成。抽濾,用蒸餾水反復(fù)沖洗濾渣。將濾渣連同濾紙一起放入65℃恒溫烘箱中烘至恒重。同樣步驟做空白實驗。凱氏定氮法測定濾渣(含濾紙)的含氮量,利用下式計算啤酒酵母蛋白粗提物的體外消化率:式中,a為樣品蛋白粗提物含氮率;b為復(fù)合酶消化后濾渣含氮率-空白樣品的含氮率。2結(jié)果與分析2.1外源型酶加入量以誘導(dǎo)劑+自溶法為基礎(chǔ)的多種破壁方法,其蛋白質(zhì)粗提物得率及粗蛋白質(zhì)提取率見表2。實驗結(jié)果表明:三種破壁方法的蛋白質(zhì)粗提物得率相差不大,但其含氮率及總氮收率由高到低順序為:方法3>方法2>方法1。酵母細(xì)胞自溶起始于細(xì)胞膜的降解,而細(xì)胞膜是由蛋白質(zhì)和脂類分子組成的超分子復(fù)合物。外源型地加入蛋白酶(如木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶等)及葡聚糖酶可以加速酵母的自溶。研究表明,蛋白酶與葡聚糖酶結(jié)合使用能大大地加速酵母細(xì)胞的自溶速度。本實驗證明,添加中性蛋白酶及β-葡聚糖酶的酶解法其酵母粗蛋白質(zhì)提取率要明顯高于無外源酶加入的方法1,而在方法2基礎(chǔ)上再增加膠體磨處理,粗蛋白質(zhì)提取率僅略有提高。由于使用膠體磨能耗較大,結(jié)合實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟和節(jié)能問題考慮,選取方法2的破壁方法,即誘導(dǎo)劑+自溶+酶解法。2.2最佳工藝參數(shù)確定L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。由表1可知,A的極差最大,其次是B、C,而D的極差最小。極差越大,反映該因素水平變化時,總指標(biāo)變化最大,即該因素對綜合指標(biāo)的影響越大,該因素越重要。因此,由極差分析可知,影響啤酒酵母自溶的因素主次順序為:溫度>時間>pH值>加酶量。其中,溫度是影響啤酒酵母自溶的最主要因素,而加酶量對其影響最小。極差分析得出最佳組合為A2B3C3D3,即溫度50℃、酶解時間40h、pH7.0、加酶量為:中性蛋白酶為25U/g干酵母,β-葡聚糖酶為15U/g干酵母。為驗證最佳工藝參數(shù),按其工藝參數(shù)提取酵母蛋白質(zhì),其總氮收率為45.23(mg/g干酵母),與正交表中第5組試驗進行對比,結(jié)果證明最佳工藝參數(shù)可靠。胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合處理法測定蛋白質(zhì)體外消化率的原理為:首先用蛋白酶在酸性條件下完成蛋白質(zhì)在胃內(nèi)的消化過程,再用胰蛋白酶繼續(xù)消化,完成其在小腸上段的消化過程,近似地模擬人體胃腸道環(huán)境。本實驗采用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合處理法,對樣品進行三組平行實驗。取三組實驗平均值計算啤酒酵母蛋白粗提物體外消化率,計算如下:結(jié)果表明:在消化道內(nèi)主要酶(胃蛋白酶及胰蛋白酶)作用下,啤酒廢酵母蛋白粗提物的體外消化率為81.06%。此數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于豆粕、玉米等植物性蛋白質(zhì)的體外消化率(分別為48.54%和36.38%),也高于魚肉蛋白的體外消化率74.16%。由此可見,本研究所提取的啤酒廢酵母蛋白粗提物中的蛋白質(zhì)易于消化,具有較高的營養(yǎng)價值。3最佳工藝條件的確定通過對比實驗,選擇誘導(dǎo)劑+自溶+酶解法作為酵母細(xì)胞破