中藥作用機(jī)制及其靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

中藥作用機(jī)制及其靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

中國擁有豐富的植物資源，中傳統(tǒng)的中藥對(duì)疾病的治療有著悠久的歷史。中藥作為我們中華民族的文化瑰寶,在我國醫(yī)藥史上發(fā)揮了不可替代的作用。而隨著時(shí)代的不斷發(fā)展,人們逐漸意識(shí)到在傳統(tǒng)中藥基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新發(fā)展的必要性。由于大多數(shù)中藥沒有明確的分子靶點(diǎn),作用機(jī)制尚不清楚,許多中藥的研發(fā)無法遵循類似西藥的從先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化再到備選藥物的主要研發(fā)歷程。系統(tǒng)構(gòu)效關(guān)系研究也幾乎不可能進(jìn)行,因此難以評(píng)價(jià)先導(dǎo)化合物對(duì)靶點(diǎn)的親和性和選擇性,從而無法保證讓最有效的化學(xué)實(shí)體進(jìn)入臨床研究。諸如此類原因使得中藥研發(fā)難以被國際醫(yī)藥主流學(xué)術(shù)界所接受,因此用科學(xué)的方法闡釋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用靶點(diǎn),實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化也成為了我國許多藥物研究工作者的重要?dú)v史責(zé)任。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer-aideddrugdesign,CADD)是通過計(jì)算機(jī)的模擬、運(yùn)算來預(yù)測小分子與受體生物大分子之間的作用,包括分子對(duì)接、藥效團(tuán)識(shí)別、定量構(gòu)效關(guān)系等技術(shù)。利用這些手段可以從分子水平上對(duì)中藥復(fù)方中包含的小分子化合物進(jìn)行研究,尋找并闡釋方中有效成分與機(jī)體靶標(biāo)受體的作用情況,從而最終確定具有藥理活性的目標(biāo)化合物。近年來,國內(nèi)許多研究機(jī)構(gòu)開始嘗試?yán)眠@項(xiàng)技術(shù)尋找中藥復(fù)方中的有效成分,并取得了相應(yīng)的研究成果。1中藥組同關(guān)鍵分析傳統(tǒng)中藥復(fù)方通常由多味藥材組成,即所謂的“君臣佐使”。中藥四氣、五味以及升降浮沉、歸經(jīng)等作為其各種特性的描述,均是通過藥物作用于人體產(chǎn)生療效而總結(jié)出的理論?！八崛敫?、辛入肺、苦入心、咸入腎、甘入脾”,可見藥味與臟腑之間有著特殊的聯(lián)系規(guī)律。一般來說,中藥組分越多則作用于機(jī)體不同途徑的靶點(diǎn)也就越多。而且,任意一味藥材都包含許多化合物,如生物堿、黃酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等,因此要確證具體某個(gè)有效成分及其相應(yīng)靶標(biāo)成為當(dāng)前藥物研究工作者的難題,解決這些問題也必將對(duì)中藥現(xiàn)代化、中醫(yī)方劑配伍、中藥質(zhì)量控制、西藥中藥化等產(chǎn)生積極影響。2cdcd的應(yīng)用領(lǐng)域CADD是隨著分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等相應(yīng)學(xué)科發(fā)展而產(chǎn)生的一種新的藥物研究手段,其應(yīng)用領(lǐng)域包括全新藥物設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)庫篩選以及藥物的構(gòu)效研究。CADD不僅能減少盲目實(shí)驗(yàn)帶來的資金浪費(fèi),做到有的放矢,而且更為高效,能縮短藥物研發(fā)周期。作為一種有效的技術(shù)手段,在對(duì)中藥作用靶點(diǎn)的預(yù)測以及推動(dòng)中藥現(xiàn)代化發(fā)展方面必將發(fā)揮重要作用。2.1構(gòu)建生物分子數(shù)據(jù)庫中藥復(fù)方本身就是一個(gè)大的分子庫,對(duì)于其中任意一味藥材的化學(xué)成分通常能通過提取分離得到確認(rèn),因此將所有小分子進(jìn)行收集整理并建立相應(yīng)的分子數(shù)據(jù)庫作為待研究的對(duì)象,將有助于尋找相應(yīng)的生物大分子靶點(diǎn)。目前,國內(nèi)外開始嘗試各種中藥活性成分的搜索工作,并開發(fā)出重要的中藥化合物數(shù)據(jù)庫,其中比較著名的有TCMDatabase@Taiwan以及中國天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(CNPD)。2.2中藥成分及功效靶點(diǎn)確證是西藥開發(fā)研究的主要技術(shù)特點(diǎn)之一,現(xiàn)代藥物研究同樣也證實(shí)了中藥所具性能的客觀物質(zhì)存在,每一味中藥成分都并非單一一種,包含了幾十乃至上百個(gè)化合物,即多成分共存的特質(zhì)。這也正是中藥作用多靶點(diǎn)、多途徑,甚至是其副作用及毒性相對(duì)較小的根本所在。功能靶點(diǎn)是指中藥直接作用的對(duì)象,從微觀上來說藥物與機(jī)體某個(gè)部位作用產(chǎn)生藥效,其實(shí)質(zhì)就是中藥的小分子化合物與機(jī)體生物大分子受體(酶、核酸等)相互識(shí)別結(jié)合的過程。2.2.1靶標(biāo)分子的選擇對(duì)于藥效作用較為明確、單一的中藥復(fù)方,可以依據(jù)信息首先從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索并搜尋出相關(guān)的靶標(biāo)大分子,并且力求全面。找到這些虛擬靶標(biāo)后,對(duì)其活性位點(diǎn)進(jìn)行分析,然后以2.1中構(gòu)建的中藥復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫與這些蛋白靶點(diǎn)依此進(jìn)行對(duì)接,并對(duì)匹配結(jié)果進(jìn)行打分,從而篩選出復(fù)方中潛在的活性成分,常用的軟件包括Dock、FlexiDock(Sybyl)等。2.2.2cytscapee預(yù)測網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)這一概念的提出,促使藥物研究的重點(diǎn)從“單一靶點(diǎn)、單一藥物”向“多靶點(diǎn)、多藥物”轉(zhuǎn)變,這也是更具前景的新型藥物研究模式。中藥作為一個(gè)擁有多組分的小分子集合體,具備針對(duì)疾病多靶點(diǎn)進(jìn)行協(xié)同作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此通過“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”的篩選可以從分子層面尋找對(duì)于疾病產(chǎn)生作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)針對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)的活性化合物及相應(yīng)的協(xié)同藥物組合模式。Cytoscape是一個(gè)在生物信息學(xué)上開發(fā)并得到廣泛應(yīng)用的軟件包,它在生物信息網(wǎng)絡(luò)可視化以及數(shù)據(jù)整合研究方面十分有效。在中藥“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究中,常包括藥物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)(drug-targetnetwork,D-Tnetwork)以及藥物-藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(drug-drugassociationnetwork,D-Dnetwork)兩方面研究。在D-Tnetwork分析中,是以與疾病所有相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)與中藥中所有的化學(xué)成分構(gòu)建出藥物-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò),Cytoscape可以將所有關(guān)聯(lián)方式顯示出來,并通過數(shù)據(jù)分析將關(guān)聯(lián)度較高的一些靶點(diǎn)篩選出來,這些靶點(diǎn)即可認(rèn)為是影響疾病的主要靶點(diǎn)。而通過D-Dnetwork分析,中藥中的某個(gè)得分高的化合物表明與多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行作用,而不僅是單一靶標(biāo),因此也可認(rèn)為是中藥中的活性成分。2.2.3基于藥分析的分子庫構(gòu)建中藥復(fù)方包含的化合物種類繁多,作用靶點(diǎn)較為復(fù)雜。而中藥之所以以其整體發(fā)揮藥效,原因可能也在于各靶點(diǎn)藥效之間相互配合,起到協(xié)同作用。因此,中藥藥效團(tuán)模型也應(yīng)區(qū)別于西藥,呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)。依據(jù)該性質(zhì),整個(gè)中藥復(fù)方小分子庫應(yīng)根據(jù)藥效團(tuán)的不同分為若干個(gè)分子集合。首先,在藥理學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上推測藥物可能作用的靶標(biāo);然后尋找針對(duì)這些靶點(diǎn)現(xiàn)有的藥物或者活性抑制劑,利用其晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建出相應(yīng)的藥效團(tuán)模型;在基于藥效特征元素基礎(chǔ)上進(jìn)行提問,通過藥效團(tuán)識(shí)別方法對(duì)2.1中構(gòu)建的分子庫進(jìn)行篩選;最后,將得到的符合條件的化合物采取重新組方并進(jìn)行活性測試,依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步對(duì)先期預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。3分子對(duì)接方法中藥抗腫瘤現(xiàn)在逐漸成為人們研究的焦點(diǎn),許多中藥也被證實(shí)具有抗腫瘤功效,并通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥抗癌機(jī)理可能包括細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞多藥耐藥作用等。陳宇綜等應(yīng)用INVDOCK進(jìn)行反向?qū)訉ふ抑兴幹芯哂袧撛诳鼓[瘤活性化合物的作用靶點(diǎn)。研究中首先選取了3個(gè)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的中藥提取物山油柑堿、黃芪苷以及大黃素作為研究對(duì)象,其抗腫瘤作用均已被證實(shí)。通過查找藥理學(xué)資料從PDB中選取與抗腫瘤作用有關(guān)的蛋白質(zhì),并利用設(shè)定好的對(duì)接位點(diǎn)條件對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行過濾,進(jìn)一步縮小數(shù)據(jù)庫規(guī)模。最后將3個(gè)化合物分別對(duì)候選的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)接篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了3個(gè)化合物各自的抗腫瘤靶點(diǎn)。其中來自植物降真香的山油柑堿主要靶標(biāo)為DNA聚合酶、β-catenin蛋白和醛糖還原酶;從黃芩中分離的黃芩苷有14個(gè)潛在的抗腫瘤作用靶點(diǎn),其中兩個(gè)已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)得到證實(shí),分別是DNA聚合酶和醛糖還原酶,余下的還未得到實(shí)驗(yàn)確證;而從植物大黃中提取的大黃素作用于蛋白激酶C、環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶以及消炎靶標(biāo)kappa-B。鄭春松等則通過選擇扶正抑瘤方和清熱消癥飲為研究對(duì)象,并結(jié)合臨床使用情況,利用分子對(duì)接的方法對(duì)中藥活性成分進(jìn)行研究。首先選擇復(fù)方中靈芝、女貞子、夏枯草及白花蛇舌草作為對(duì)象,并依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建出復(fù)方中包含的化合物小分子庫,共計(jì)285個(gè)結(jié)構(gòu)。通過藥理、藥化等有關(guān)資料,選擇了部分已經(jīng)得到確證與治療腫瘤有關(guān)的靶標(biāo),結(jié)構(gòu)均來自于PDB庫。對(duì)接采用Accelrys公司提供的Cerius2分子設(shè)計(jì)軟件包,通過各靶標(biāo)與構(gòu)建的小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方中4個(gè)單味中藥自身具有多靶點(diǎn)效應(yīng),而且各味藥之間又存在對(duì)同一靶點(diǎn)相互協(xié)同以及不同靶點(diǎn)之間相互補(bǔ)充的作用。如靈芝中的化學(xué)成分作用的靶點(diǎn)包括表皮生長因子受體、抑制凋亡基因Bcl-x1、腫瘤壞死因子α、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2;而女貞子中化合物的作用靶點(diǎn)除上述外還作用于血管內(nèi)皮生長因子受體2、白細(xì)胞介素-2以及環(huán)氧化酶-2等。由此,進(jìn)一步說明了對(duì)消化道腫瘤選擇扶正抑瘤方和清熱消癥飲聯(lián)合使用,療效更為顯著。3.2糖敏靈丸在型糖尿病治療中的應(yīng)用針對(duì)Ⅱ型糖尿病的治療,現(xiàn)有的藥物只能從癥狀上對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié),但卻不能根治,這在于糖尿病致病機(jī)理比較復(fù)雜,涉及的蛋白靶標(biāo)眾多,因此普通藥物只能對(duì)其中某一環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。最近由天津天士力公司開發(fā)的中藥制劑糖敏靈丸臨床上被證明能明顯改善新診斷Ⅱ型糖尿病伴代謝綜合征患者的各項(xiàng)指標(biāo),保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。該制劑由11味中草藥組成,包括:柴胡、柑橘、大黃等。北京大學(xué)的許筱杰等在中藥對(duì)Ⅱ型糖尿病治療的“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”課題研究中,對(duì)糖敏靈丸進(jìn)行了分析。復(fù)方中的11味中藥成分共包含676個(gè)小分子化合物,它們的結(jié)構(gòu)全部來自于貝爾斯坦(Beilstein)數(shù)據(jù)庫以及中草藥數(shù)據(jù)庫(CHDD),與Ⅱ型糖尿病相關(guān)的37個(gè)蛋白靶點(diǎn)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(RSCBproteindatabank)獲得。虛擬篩選采用了Cerius2軟件中的flexibledocking程序,將37個(gè)靶點(diǎn)分別與676個(gè)化合物進(jìn)行對(duì)接。然后利用Cytoscape2.8.1軟件分別建立藥物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)以及藥物-藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),在D-Tnetwork分析中,藥物與靶標(biāo)關(guān)系的建立前提是某個(gè)化合物與其中一個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果得分在前20名以內(nèi);而D-Dnetwork分析中,2個(gè)小分子間是否關(guān)聯(lián)取決于它們是否同時(shí)對(duì)某一個(gè)或者更多的靶點(diǎn)有效。最后發(fā)現(xiàn)糖原合成酶激酶-3β、蛋白激酶C以及胰高血糖素樣肽-1受體等與疾病的關(guān)聯(lián)較之其它靶標(biāo)更為密切。而且,分析結(jié)果表明復(fù)方中起關(guān)鍵作用的某些化合物有些已被報(bào)道具有降糖作用,其它一些如大黃二蒽酮(rheidin)A、番瀉葉甙、前青花素C1等則很可能具備潛在對(duì)抗Ⅱ型糖尿病活性。由此證明中藥復(fù)方中的多組分,并同時(shí)對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行干擾可能是其發(fā)揮療效的根本原因。3.3中藥傳統(tǒng)模型的建立藥效團(tuán)是一種基于配體的常用研究方法,張燕玲等在現(xiàn)代藥理研究基礎(chǔ)上,利用藥效團(tuán)篩選方法,對(duì)活血化瘀類中藥的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了探討。已有研究發(fā)現(xiàn)中藥在防治心血管疾病方面基本通過改善微循環(huán)、改善血液流變學(xué)以及抗血栓形成等方面發(fā)揮作用,因此張燕玲等選擇了多種相應(yīng)的心血管受體作為研究對(duì)象,其中包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconvertenzyme,ACE)受體、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受體、血小板激活因子(plateletactivatingfactor,PAF)受體以及5-羥色胺受體。作者首先對(duì)已經(jīng)明確具有活血化瘀功效的27味傳統(tǒng)中藥進(jìn)行歸納,構(gòu)建出相應(yīng)的中藥化學(xué)成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,用于虛擬篩選。藥效團(tuán)的構(gòu)建采用Accelrys公司開發(fā)的Catalyst軟件,對(duì)上述4個(gè)ACE、AngⅡ、PAF、5-HT心血管受體抑制劑藥效團(tuán)進(jìn)行識(shí)別后,則分別對(duì)先期構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥效團(tuán)篩選,命中結(jié)果顯示在27味中藥中有7味具有潛在的ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受體拮抗活性,從而對(duì)中藥的作用靶點(diǎn)及機(jī)理進(jìn)行了解釋,并且從另一側(cè)面驗(yàn)證了所構(gòu)建藥效團(tuán)模型的合理性。研究最后將該藥效團(tuán)模型對(duì)鄧中甲主編的《方劑學(xué)》中列舉的18首活血化瘀方劑進(jìn)行虛擬篩選,其中包括桃核承氣湯、大黃蜇蟲湯等名方,結(jié)果顯示18首方劑中的65味中藥中,有19味包含ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受體拮抗劑活性成分,進(jìn)一步闡釋了方劑整體療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理。4不同結(jié)構(gòu)的配體分子身份證研究中藥因其成分復(fù)雜、作用機(jī)理不明確等原因,阻礙其創(chuàng)新與發(fā)展,進(jìn)而影響了其走向世界的進(jìn)程。隨著越來越多的醫(yī)藥工作者投身于中藥現(xiàn)代化研究中,各種先進(jìn)的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,比如基因工程技術(shù)、酶工程技術(shù)等,都對(duì)中藥研究做出了巨大的貢獻(xiàn)。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)作為一種新型的藥物研究手段,其特點(diǎn)之一便在于使用計(jì)算機(jī)模擬方法揭示出藥物與其受體之間的關(guān)系。而CADD技術(shù)用于中藥復(fù)方的研究中,即是傳統(tǒng)與現(xiàn)代技術(shù)的一次有效的融合,其可行性也已經(jīng)得到實(shí)踐充分證明。CADD技術(shù)作為對(duì)中藥研究的一種有益嘗試,必將與其他研究手段一起推動(dòng)我國的中醫(yī)藥事業(yè)不斷向前創(chuàng)新與發(fā)展。分子對(duì)接(moleculardocking)是依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”,模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用。配體與受體相互作用是分子識(shí)別的過程,主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(proteindatabank,PDB)專門收錄蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu),目前該數(shù)據(jù)庫共包含77878個(gè)結(jié)構(gòu),并且每年仍以較快的速度增長。利用這一有效的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)資源,有學(xué)者應(yīng)用“反向?qū)印狈椒ㄟM(jìn)行中藥有效成分靶標(biāo)的確認(rèn)。其中,TarFisDock程序是利用一個(gè)小分子(藥物、先導(dǎo)化合物或者天然產(chǎn)物)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)接,并且每個(gè)對(duì)接結(jié)果都進(jìn)行打分,最終按得分排序結(jié)果挑選出2%的候選蛋白質(zhì)定為潛在的靶標(biāo),進(jìn)而利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,依據(jù)用藥前后影響蛋白質(zhì)表達(dá)的變化最終篩選出可能的作用靶點(diǎn)。TarFisDock可以提供一定的信息來指導(dǎo)實(shí)驗(yàn),在一定程度上彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ牟蛔?從而對(duì)中藥作用靶標(biāo)的確認(rèn)提供一定的幫助,輔助中藥現(xiàn)代化。系統(tǒng)生物學(xué)表明許多復(fù)雜的疾病,如:癌癥、心血管系統(tǒng)疾病,其致病并非由單純某一因素引起,而是諸多基因缺陷累加的結(jié)果,因此可以推測某一疾病可以對(duì)應(yīng)存在多個(gè)作用靶點(diǎn)。近年來多向藥理學(xué)(polypharmacology)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(networkpharmacology)的興起給當(dāng)今新藥