水稻對南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程

I水稻對南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了水稻品種（資源）抗南方水稻黑條矮縮病（病原：南方水稻黑條矮縮病毒Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV）田間病圃鑒定和人工接種鑒定的技術(shù)方法。本文件適用于水稻品種（資源）對南方水稻黑條矮縮病的抗性鑒定和抗南方水稻黑條矮縮病水稻種質(zhì)資源篩選。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15794稻飛虱測報調(diào)查規(guī)范NY/T2631南方水稻黑條矮縮病測報技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本文件。

感病對照品種TN1TN1：高感南方水稻黑條矮縮病的秈型常規(guī)水稻品種XX本地1號，簡稱感病品種TN1。

感病株表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病癥狀的水稻植株。

感病株率病株占調(diào)查水稻植株總數(shù)的百分率。

無毒白背飛虱經(jīng)檢測不攜帶南方水稻黑條矮縮病毒的白背飛虱。

有效鑒定株數(shù)分蘗盛期或拔節(jié)初期存活的參鑒水稻株數(shù)。原理南方水稻黑條矮縮病主要是由白背飛虱帶毒引起，該病的發(fā)生輕重與水稻品種抗性、白背飛虱的蟲源基數(shù)和帶毒率、耕作制度、白背飛虱遷入期與水稻敏感期的吻合度等關(guān)系密切，一般同時具備以上有利于病害發(fā)生的條件，病害必將發(fā)生較重。病害發(fā)生率基本等于損失率，一旦大面積暴發(fā)，將造成嚴(yán)重減產(chǎn)（90%以上），甚至絕收。試劑與設(shè)備可調(diào)控溫光的養(yǎng)蟲室（溫度保持于（26±1）℃范圍內(nèi)，相對濕度80%～90%，光照每天12h）；1000mL玻璃或透明塑料杯、尼龍紗布（網(wǎng)眼規(guī)格1mm）、養(yǎng)蟲架、適宜白背飛虱繁殖的水稻種子（宜采用白背飛虱喜食性品種如TN1等）；轉(zhuǎn)移白背飛虱用黑布、試管、吸蟲管等。田間病圃鑒定6.1田間自然誘發(fā)鑒定6.1.1鑒定病圃的選擇與設(shè)置在螟蟲發(fā)生較輕且白背飛虱常穩(wěn)定發(fā)生地區(qū)，選擇四周種植白背飛虱適生寄主且近年重發(fā)南方水稻黑條矮縮病田塊（上年度水稻感病對照品種TN1在不防治條件下分蘗期病株率大于30%，抽X黃熟期達(dá)到50%以上的田塊）作為田間鑒定病圃。6.1.2鑒定病圃的試驗設(shè)計6分行初步篩選將不同播期TN1秧苗充分混合移栽做保護(hù)行和誘發(fā)行，每行TN1單本移栽6株，保護(hù)行或誘發(fā)行之間預(yù)留10株參試品種空間。水稻參試品種按同樣規(guī)格單本移栽于TN1保護(hù)行或誘發(fā)行之間，各品種移栽3行，每行10株，試驗在秧苗和XX期均呈隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。6.1.2.2小區(qū)重復(fù)鑒定各參試品種及對照均單本移栽于誘發(fā)行與保護(hù)行之間，各小區(qū)移栽12行，每行10株，試驗設(shè)計同分行初步篩選。6.1.3播種與移栽在常年第一代白背飛虱遷入或發(fā)生高峰前7d～10d播種感病對照品種TN1，每隔10d再播種一次，共播種3次～4次，直至第一代白背飛虱遷入或田間白背飛虱已形成一定的種群數(shù)量。參試品種播種一次，播種時期較當(dāng)?shù)厣a(chǎn)常規(guī)播種期晚5d～10d。種子經(jīng)浸泡、催芽、育苗移栽方式種植。育秧方式為濕潤育秧，苗床上感病對照品種TN1撒播，參試品種分行條播，苗床首尾及每10行參試品種間隔播種一行感病對照品種TN1，播種密度為30kg～40kg/667m2。播種后30d～35d移栽，每品種單本移栽，株行距為15cm×18cm。6.1.4水肥管理灌溉水與常規(guī)管理一致。秧田期較常規(guī)管理增施尿素5kg/667m2。XX管理較常規(guī)肥水管理增施尿素10kg/667m2。以增強(qiáng)對傳毒介體白背飛虱的引誘，誘發(fā)南方水稻黑條矮縮病。6.1.5鑒定圃施藥鑒定圃全生育期不使用抗病毒劑，二代若蟲發(fā)生期之前不使用殺蟲劑，在苗床和拔節(jié)初期用阿維菌素或甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽防治一次稻縱卷葉螟和螟蟲。6.1.6白背飛虱蟲量及帶毒率調(diào)查6.1.6.1蟲量調(diào)查白背飛虱一代成蟲發(fā)生峰期調(diào)查苗床，五點取樣，分蘗盛期在XX平行跳躍取樣，每塊田取樣3叢，參照GB/T15794-2009，用瓷盤拍蟲法統(tǒng)計蟲量。6.1.6.2帶毒率調(diào)查XX間一代白背飛虱成蟲發(fā)生高峰期，在鑒定圃捕捉高齡若蟲或成蟲500頭以上，從中隨機(jī)選取100頭，參照附錄A用RT-PCR檢測或Dot-ELISA（NY/T

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附錄C）檢測種群帶毒率。6.1.6.3有效傳毒蟲量計算田間鑒定的有效傳毒蟲量用FVS表示，按式（1）計算。FVS=N×PVS………………（1）式中：FVS——田間鑒定的有效傳毒蟲量，單位為頭每公頃（頭/hm2）；N——白背飛虱蟲量，單位為頭每公頃（頭/hm2）；PVS——白背飛虱帶毒率，單位為百分率（%）。計算結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。當(dāng)FVS值處于1.5×106～6.0×106頭/hm2范圍內(nèi)，方可認(rèn)為試驗有效。6.2病情調(diào)查6.2.1調(diào)查時間和內(nèi)容6.2.1.1拔節(jié)期調(diào)查參試水稻品種進(jìn)入拔節(jié)期后，每隔7d調(diào)查一次，直至所有品種進(jìn)入拔節(jié)期。調(diào)查有效鑒定株數(shù)和明顯矮縮不能拔節(jié)株數(shù)。6抽X黃熟期調(diào)查參試水稻品種抽X黃熟后，每隔7d調(diào)查一次，共調(diào)查3次～4次，直至所有品種均進(jìn)入全X黃熟期，調(diào)查參試水稻的存活株數(shù)和存活、死亡的病株數(shù)。6.2.2病株標(biāo)準(zhǔn)6.2.2.1分蘗、拔節(jié)期癥狀病株分蘗增多叢生，上部數(shù)片葉的葉枕重疊，心葉破下葉葉鞘而出或從下葉枕口呈螺旋狀伸出，葉片短而僵直，葉尖略有扭曲畸形。嚴(yán)重發(fā)病植株矮小，不能拔節(jié)；多數(shù)單株能夠拔節(jié)，矮化癥狀明顯或不明顯。6.2.2.2抽X黃熟期癥狀重病單株已矮化、死亡。輕病株全株或一個以上分蘗明顯矮化常伴有高位分蘗，不能抽X，或相對抽X遲而小、實粒少、粒重輕，半包在葉鞘里，穎殼全部或部分變褐色，劍葉短小僵直；在中上部葉片基部可見縱向皺褶；在莖稈下部節(jié)間和節(jié)上可見蠟白色或黑褐色瘤狀突起。以黃熟期初期植株有1個以上不孕、不實（結(jié)實粒少于全X1/3）分蘗癥狀為感病單株判定標(biāo)準(zhǔn)。6.2.2.3南方水稻黑條矮縮病病情級別及癥狀見附錄B表B2。6.2.3相對發(fā)病率計算抽X黃熟期調(diào)查、計算感病對照的感病株率，若出現(xiàn)感病對照品種TN1的感病株率未達(dá)80%，則認(rèn)定本鑒XX果不可用。抽X黃熟期感病株率用Rif表示，數(shù)值以%計，按式（2）計算：Rif=（nif+nd）/（ntf+nd）×100%…………（2）式中:Rif——抽X黃熟期感病株率，單位為百分率（%）；nif——抽X黃熟期感病株數(shù)，單位為株；nd——分蘗期感病株且在抽X黃熟期死亡株數(shù)，單位為株；ntf——抽X黃熟期存活總株數(shù)，單位為株。計算結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。相對發(fā)病率Rr表示，數(shù)值以%計，按式（3）計算：Rr=Rif/Rsf×100%…………（3）式中:Rr——抽X黃熟期相對發(fā)病率，單位為百分率（%）；Rif——抽X黃熟期感病株率，單位為百分率（%）；Rsf——抽X黃熟期感病對照的感病株率，單位為百分率（%）；計算結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。人工接種鑒定7.1接種用白背飛虱的準(zhǔn)備7.1.1白背飛虱的采集白背飛虱若蟲或成蟲采集自田間。7.1.2無毒白背飛虱種群的獲得選取飼喂白背飛虱的水稻種子用水浸種24h后，紗布覆蓋，恒溫箱（32±2）℃催芽（24h～48h），選取發(fā)芽良好的種子（25?！?0粒）均勻播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中（內(nèi)徑80mm～110mm）；大約6d～7d后，待苗長至1.5葉期時，將待產(chǎn)的單頭白背飛虱移入杯中產(chǎn)卵，約3d后將成蟲移出，單獨(dú)保存，7d～10d后孵化出若蟲。按NY/T

2631-2014附錄C的規(guī)定對產(chǎn)卵的白背飛虱進(jìn)行檢測，篩選其中無毒白背飛虱的后代進(jìn)行繁殖，每批隨機(jī)取出30頭～50頭白背飛虱進(jìn)行帶毒率檢測，帶毒率始終為0%，則該批白背飛虱為無毒白背飛虱種群。7.2病株準(zhǔn)備7.2.1病株的采集在重病區(qū)采集表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病疑似癥狀的水稻植株種植在防蟲網(wǎng)籠中的塑料桶中。7.2.2病株檢測確定采病株葉片按NY/T

2631-2014附錄C的規(guī)定或參考附錄A進(jìn)行檢測，確認(rèn)感染南方水稻黑條矮縮病毒則作為毒源保存，并經(jīng)白背飛虱接種擴(kuò)繁病株。7.3飼毒方法將7.2的病株種于大燒杯（內(nèi)徑100mm～200mm）中，土面覆蓋濾紙，將適量1齡～2齡無毒白背飛虱移入其中，并用60目防蟲網(wǎng)封口。飼毒2d后將蟲移入塑料杯（內(nèi)徑80mm～110mm，預(yù)先育有白背飛虱喜食品種如TN1的秧苗）中飼養(yǎng)，11d后，每批隨機(jī)取出30頭白背飛虱高齡若蟲或成蟲，按NY/T

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附錄C的規(guī)定檢測白背飛虱種群帶毒情況，計算白背飛虱種群的帶毒率。7.4育苗方法參試品種（含感病對照）經(jīng)6.1.3方法浸種、催芽；選取30粒左右發(fā)芽良好的種子均勻播于盛有自然肥力土壤的塑料杯（內(nèi)徑80mm～110mm）中。每參試品種重復(fù)3次。7.5接種時期水稻幼苗生長至1.5～2葉齡期。7.6接種方法及數(shù)量選取7.3已飼毒且度過循回期的白背飛虱成蟲接種種群，并計算有效接種蟲量，人工接種鑒定的有效接種蟲量用IVS表示，數(shù)值以頭/苗計，按式（4）計算：IVS=N×PVS………………（4）式中:IVS——人工接種鑒定的有效接種蟲量，單位為頭/株；N——接種白背飛虱數(shù)量，單位為頭。當(dāng)IVS值處于1～2頭/株范圍內(nèi)，方可認(rèn)為試驗有效。從接種種群中隨機(jī)抽取50頭以上蟲，測定帶毒率，計算接蟲數(shù)量后接入已育有參試品種的塑料杯（內(nèi)徑80～110mm）中，接種時間為2d，接種溫度（26±1）℃，且每天上午和下午各趕蟲一次，使白背飛虱分布均勻，2d后用殺蟲劑將接種用白背飛虱全部撲殺，將秧苗移出塑料杯，至15℃～30℃條件下培育，常規(guī)管理，定期觀察植株發(fā)病情況。7.7調(diào)查時間接種20d后進(jìn)行調(diào)查；共調(diào)查3次，每次調(diào)查間隔期不少于7d，第一次調(diào)查時同時確定有效鑒定株數(shù)。7.8調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)7.8.1南方水稻黑條矮縮病苗期發(fā)病癥狀①秧苗葉色濃綠，葉片短小僵直，心葉扭曲；②植株矮化不明顯，莖稈或葉背有縱向不規(guī)則蠟白色瘤狀突起，后變黑褐色；③植株矮小，葉色稍濃綠。7.8.2病株標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)①或②癥狀的植物直接記為病株；出現(xiàn)③癥狀的植株，用Dot-ELISA（按NY/T

2631-2014附錄C的規(guī)定）或RT-PCR檢測確認(rèn)（參考附錄A）。7.9相對發(fā)病率計算若出現(xiàn)感病對照的平均感病株率小于30％，則重復(fù)進(jìn)行試驗。按式（3）方法計算相對發(fā)病率。苗期感病株率用Rit表示，數(shù)值以%計，按式（5）計算：Rit=nit/ntt×100%…………（5）式中:Rit——苗期感病株率，單位為百分率（%）；nit——苗期感病株數(shù)，單位為株；ntt——接種病毒的總株數(shù)，單位為株。計算結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病性狀的評價8.1抗性分級標(biāo)準(zhǔn)田間鑒定和人工接種鑒定均根據(jù)相對發(fā)病率進(jìn)行抗性評價，抗性分級標(biāo)準(zhǔn)見表B1南方水稻黑條矮縮病抗性評價分級標(biāo)準(zhǔn)，以最后的抗性表現(xiàn)為準(zhǔn)。8.2抗性評定當(dāng)品種抗性在不同地區(qū)間、不同年度間或批次間鑒XX果表現(xiàn)不一致時，以最差的抗性表現(xiàn)為準(zhǔn)。匯總報告格式9.1試驗概況概述試驗?zāi)康?、鑒定材料、鑒定單位、鑒定方法與評價標(biāo)準(zhǔn)等基本情況。9.2結(jié)果與分析以各試驗組別為單位，分析評價各品種的抗性表現(xiàn)，列出相應(yīng)的數(shù)據(jù)表。格式參照附錄C的表C1。9.3小結(jié)與討論首先根據(jù)感病對照品種鑒XX果闡明該年度抗性鑒XX果的有效性，再對試驗品種的抗性概況進(jìn)行簡要描述。

（資料性附錄）

南方水稻黑條矮縮病毒檢測技術(shù)-RT-PCR法試劑除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器，可用1‰DEPC（焦碳酸乙二酯）水處理后高壓滅菌并分裝。A.1.1液氮：可保存于液氮罐或保溫桶中。A.1.2TRIzolReagents（購于Invitrogen公司）。A.1.3氯仿。A.1.4異丙醇：-20℃預(yù)冷。A.1.575%

酒精（DEPC水配制）。A.1.6DEPC水：用1‰DEPC處理后的去離子水，用于溶解RNA。A.1.7X脂糖。A.1.8Tris堿。A.1.9冰乙酸。A.1.10EDTA（0.5mol/L）。A.1.1150×TAE配方:Tris堿242g；冰乙酸57.1ml；EDTA（0.5mol/L）100ml，定容至1000ml。A.1.12PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKit一步反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自寶生物工程（XX）有限公司）。A.1.14DNAMarker（國產(chǎn)）。A.1.15Gelred核酸染色工作液（國產(chǎn)，購于XX李記生物科技有限公司）參照使用說明進(jìn)行。儀器設(shè)備稱量天平：精度等級為0.01g。A.2.2高速臺式冷凍離心機(jī)（離心速度12000r/min以上）。A.2.3冰箱（2℃～8℃和-20℃兩種）。A.2.4微量可調(diào)移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）及配套帶濾芯吸頭。A.2.5Eppendorf管（0.2mL、1.5mL、2.0mL）。A.2.6研砵。檢測引物正向引物SRB-S10-F5’-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3’反向引物SRB-S10-R5’-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3’試驗操作采樣工具下列采樣工具必須經(jīng)（121±2）℃，15min高壓滅菌并烘干：剪刀，鑷子，研缽，Eppendorf管（0.2mL、1.5mL、2.0mL），吸頭。樣品采集用剪刀剪取新鮮水稻葉片或莖稈組織，放入密閉的自封袋內(nèi)（一個采樣點的樣品，放一個塑料袋），置于裝有液氮的保溫桶內(nèi)，盡快運(yùn)回實驗室4℃條件下保存待檢，存放不能超過7d。樣品保存新鮮樣品若需長期保存應(yīng)置于-70℃以下，避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。樣品處理取水稻組織0.1g，放入研缽中，倒入適量液氮，以研磨棒將樣本磨碎至粉末狀，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中。按照0.1g樣品/1mLTRIzolreagent，加入適量TRIzolreagent，充分混勻。每1mLTRIzolreagent加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，充分震蕩15s，室溫靜置5min；12000r/min，4℃離心15min。吸取A各管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中，切勿吸到中間層，向Eppendorf管中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。12000r/min，4℃離心10min，棄上清，加入600μL75％乙醇，上下顛倒洗滌。12000r/min，4℃離心5min（Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），棄上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。4000r/min離心10s（Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到沉淀，室溫干燥3min～5min；不能過于干燥，以免RNA不溶。加入10μL～15μLDEPC水，輕輕混勻，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；若需長期保存須放置-70℃冰箱。檢測擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備從試劑盒中取出相應(yīng)的RT-PCR反應(yīng)液，設(shè)所需RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見表A1。表A1每個樣品測試反應(yīng)體系試劑使用量終濃度PrimeScript1StepEnzymeMix1μL2×1StepBuffer（DyePlus）10μL正向引物SRB-S10-F1μL0.4μM反向引物SRB-S10-R1μL0.4μMTemplateRNA1μL～3μLRNaseFreedH2O補(bǔ)充反應(yīng)體積至20μL循環(huán)條件設(shè)置將A中離心后的PCR管放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置：第一階段，反轉(zhuǎn)錄50℃/30min；第二階段，預(yù)變性94℃/2min；第三階段，94℃/30s，58℃/30s，72℃/1min，25～30個循環(huán)；第四階段：72℃延伸5min。電泳檢測取PCR反應(yīng)液（約5μL）于1%X脂糖凝膠中電泳（120V，0.5×T