第四章 酶生物傳感器

章酶生物傳感器EnzymeBiosensor一、酶的本質(zhì)與特征㈠酶的本質(zhì)酶是生物體內(nèi)產(chǎn)生的、具有催化活性的一類蛋白質(zhì)。根據(jù)化學(xué)組成分為兩大類，即單純蛋白酶與結(jié)合蛋白酶。根據(jù)酶的催化反應(yīng)類型分為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、異構(gòu)酶等。2021/5/91㈡酶的基本特征

●酶的高效催化性酶的催化效率通常比一般催化劑高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是通過(guò)降低反應(yīng)所需的活化能實(shí)現(xiàn)的。

2021/5/92●酶的高度特異性酶不僅具有一般催化劑加快反應(yīng)速度的作用，而且具有高度的特異性。

絕對(duì)特異性相對(duì)特異性立體異構(gòu)特異性2021/5/93㈢酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶反應(yīng)速度及各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度影響的科學(xué)。

主要影響因素包括有：底物濃度、酶濃度、pH值、溫度、抑制劑與激活劑等。

2021/5/94

酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定的是初速度，是指酶在反應(yīng)過(guò)程中底物初始濃度被消耗在5%以內(nèi)的速度。目的是排除酶反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)的各種干擾因素，以便測(cè)得準(zhǔn)確的酶反應(yīng)速度。

2021/5/95⑴底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

2021/5/96⑵酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

若底物初始濃度固定時(shí)，酶反應(yīng)速度與酶濃度呈線性關(guān)系。2021/5/97⑶溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

每一種酶的催化反應(yīng)都有適宜的溫度范圍和最適溫度。2021/5/98⑷pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

每一種酶都有適宜的pH值范圍和最適pH值。在一定的pH下，酶促反應(yīng)具有最高的反應(yīng)速度，此pH稱為該酶的最適pH。

2021/5/992021/5/910⑸抑制劑、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響凡能降低酶的活性甚至使酶完全失活的物質(zhì)稱為抑制劑，抑制劑的種類很多，包括藥物、抗生素、毒物、抗代謝物以及酶促反應(yīng)產(chǎn)物等。2021/5/91112凡能激活酶活性的物質(zhì)，均稱激活劑。某些酶必須有激活劑存在，才能進(jìn)行酶促反應(yīng)。激活劑大部分為某些無(wú)機(jī)離子，也有一些有機(jī)分子。2021/5/912二、酶?jìng)鞲衅?/p>

酶?jìng)鞲衅魇菓?yīng)用固定化酶作為敏感元件與各種信號(hào)轉(zhuǎn)換器組合而成的生物傳感器。

依據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的類型，酶?jìng)鞲衅鞔笾驴煞譃槊鸽姌O、酶場(chǎng)效應(yīng)管傳感器、酶熱敏電阻傳感器、酶壓電晶體型、光纖光學(xué)型等。

2021/5/913

傳感器的類型2021/5/9144.1酶電極傳感器

Enzymeelectrode

sensor

酶電極是由固定化酶與電流型電極或電位型電極組合而成的生物傳感器。

具有酶的分子識(shí)別和選擇催化功能，又有電化學(xué)電極響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，能快速測(cè)定試液中某一給定化合物的濃度，且需很少量的樣品。

2021/5/915㈠電流型酶電極

電流型酶電極是將酶促反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)在電極上發(fā)生氧化或還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流作為測(cè)量信號(hào)，在一定條件下，利用測(cè)得的電流信號(hào)與被測(cè)物活度或濃度的函數(shù)關(guān)系，來(lái)測(cè)定樣品中某一生物組分的活度或濃度。

2021/5/91617制作生物傳感器最常用的是氧化酶：

底物+O2

產(chǎn)物+H2O22021/5/917基礎(chǔ)電極可采用氧、過(guò)氧化氫電極，還可采用近年開(kāi)發(fā)的介體修飾的炭、鉑、鈀和金等固體電極或介體修飾電極。2021/5/918

氧電極：是一個(gè)通過(guò)測(cè)定電解電流來(lái)測(cè)定溶液中氧含量的電解池。工作時(shí)，在鉑陰極和Ag陽(yáng)極之間施加0.6V的電壓。當(dāng)E=-0.2V時(shí)電極開(kāi)始電解，產(chǎn)生還原電流，其還原反應(yīng)式為：

2021/5/919使用最多的是封閉式的Clark氧電極2021/5/920

鉑電極與Ag電極組合在一起置于參比溶液中，與被測(cè)溶液之間用透氧膜隔開(kāi)。被測(cè)溶液中的溶解氧通過(guò)膜擴(kuò)散到電解質(zhì)溶液薄層，再擴(kuò)散到鉑電極表面進(jìn)行還原產(chǎn)生電流。

2021/5/921H2O2電極H2O2電極基本測(cè)量電路和電壓-電流曲線

2021/5/922

兩極間外加一定電壓，實(shí)際測(cè)量時(shí)，外加電壓控制在電壓-電流曲線的平滑部分，即0.7-0.9V，此時(shí)輸出電流就與濃度成比例。陽(yáng)極反應(yīng)陰極反應(yīng)

2021/5/9232021/5/9241.葡萄糖傳感器

葡萄糖傳感器是研究最早、開(kāi)發(fā)最成熟并已市場(chǎng)化的生物傳感器，即血糖儀。各種型號(hào)的血糖儀產(chǎn)品2021/5/925（1）早期的葡萄糖傳感器

早期的葡萄糖傳感器是由葡萄糖氧化酶膜和電化學(xué)電極組成的。在電化學(xué)電極的透氣膜上固定葡萄糖氧化酶。2021/5/926當(dāng)葡萄糖溶液與酶膜接觸時(shí)，發(fā)生如下反應(yīng)：

2021/5/92728

故葡萄糖濃度測(cè)試方法有三種：

生成的葡萄糖酸

消耗的氧

生成的H2O2

2021/5/928測(cè)量葡萄糖酸的葡萄糖傳感器：

pH電極和離子敏場(chǎng)效應(yīng)管測(cè)定葡萄糖酸的量來(lái)計(jì)算樣品中葡萄糖的含量，最低檢測(cè)限為10-3mol／L，靈敏度較低；

2021/5/929測(cè)量氧消耗量的葡萄糖傳感器：

Clark氧電極用于測(cè)定酶促反應(yīng)中氧的消耗量(電流降低的量)來(lái)計(jì)算樣品中葡萄糖的含量，最低檢測(cè)限為10-4

mol／L。2021/5/930

葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2，H2O2通過(guò)選擇性透氣膜，在Pt電極上氧化，葡萄糖的含量與生成的電流成正比，由此可測(cè)出葡萄糖的濃度。

檢測(cè)H2O2的方法的本底電流小，靈敏度高，其最低檢出限為10-8mol／L。

測(cè)量H2O2生成量的葡萄糖傳感器：2021/5/931（2）改進(jìn)的葡萄糖傳感器

為消除環(huán)境中氧對(duì)測(cè)定的干擾，用四硫富瓦烯、二茂鐵等容易在電極上氧化還原的介體來(lái)代替氧的電子傳遞作用。電子介體是酶氧化還原活性中心與電極表面之間的電子傳遞中介物，在電流型酶電極中起著關(guān)鍵性作用。

各種電子傳遞介體的使用，使得電流型酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)速度、檢測(cè)靈敏度和選擇性都得到了很大的提高。2021/5/932

方法：將葡萄糖氧化酶和電子介體同時(shí)包埋于聚合物膜中，或直接修飾于電極的表面構(gòu)成葡萄糖酶?jìng)鞲衅鳌?/p>

2021/5/933

在葡萄糖氧化酶（）的催化下，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸，再由二茂鐵離子將還原型葡萄糖氧化酶（）氧化為氧化型葡萄糖氧化酶（），然后二茂鐵在電極上氧化成二茂鐵離子，通過(guò)二茂鐵在電極上產(chǎn)生的氧化電流來(lái)實(shí)現(xiàn)葡萄糖含量的檢測(cè)。2021/5/93435介體傳感器的特點(diǎn)：僅用較低的電壓就能使介體氧化。傳感器對(duì)氧不敏感，能在缺氧和氧濃度變化的條件下使用。二茂鐵離子與還原GOD之間的電子傳遞快，電極響應(yīng)迅速。2021/5/93536采用場(chǎng)效應(yīng)晶體管和微電極做換能器，以縮小傳感器的體積；

利用電子技術(shù)、改善信號(hào)放大和顯示方法，使其易于商品化；

改善采樣方法，使患者使用方便或更易于臨床應(yīng)用。

最重要的改進(jìn)是使用化學(xué)電子傳遞中間介體代替作為自然電子受體的氧，使酶催化反應(yīng)不再受到溶解氧含量的制約。

2021/5/936（3）血糖儀測(cè)試片

血糖儀測(cè)試片

2021/5/937手表式的葡萄糖傳感器2021/5/9382021/5/939

手表式無(wú)創(chuàng)血糖儀是近年來(lái)出現(xiàn)的一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛，能連續(xù)測(cè)定血糖的設(shè)備。它通過(guò)電化學(xué)傳感器和電滲透原理來(lái)檢測(cè)皮下組織液中的葡萄糖濃度，無(wú)需針刺采血。

手表式血糖儀測(cè)定的是組織間液葡萄糖值，因此要略滯后于指血血糖值。

2021/5/94041(2)乳酸電極

血液中乳酸的濃度是反映人體體力消耗程度的重要指標(biāo)。在體育運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中乳酸的檢驗(yàn)是極為必要，國(guó)際上乳酸傳感器已經(jīng)有成熟的商品儀器。

2021/5/9412021/5/94243

還可采用介體修飾的方法制備乳酸傳感器。

在電極上滴介體四硫富瓦烯(TTF)漿液，晾干后，將乳酸氧化酶固定在該電極表面修飾層上面，即構(gòu)成乳酸傳感器。2021/5/943442021/5/94445

在乳酸氧化酶的催化下，乳酸被氧化為丙酮酸，再由四硫富瓦烯離子將還原型乳酸氧化酶氧化為氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在電極上氧化成四硫富瓦烯離子，通過(guò)四硫富瓦烯在電極上產(chǎn)生的氧化電流來(lái)實(shí)現(xiàn)乳酸含量的檢測(cè)。2021/5/945(3)膽固醇電極

膽固醇電極是一種用于臨床測(cè)定血清膽固醇含量的電流型酶?jìng)鞲衅?。血液中膽固醇約有2／3以酯型存在，1／3以游離型存在。2021/5/946

自然界中的膽固醇主要存在于動(dòng)物性食物之中，植物中沒(méi)有膽固醇。獸肉的膽固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，貝殼類和軟體類高于一般魚(yú)類，蛋黃、魚(yú)子、動(dòng)物內(nèi)臟的膽固醇含量非常高。

2021/5/947降低膽固醇的食物：§含膳食纖維豐富的食物§

VC與VE§飲酒可能使血中的高密度脂蛋白升高，加強(qiáng)防治高膽固醇血癥的作用。葡萄酒較合適，但必須嚴(yán)格限制攝入量。

2021/5/94849

膽固醇電極是一種用于臨床測(cè)定血清膽固醇含量的電流型酶?jìng)鞲衅鳌＝Y(jié)合型酶電極2021/5/949

根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中消耗的氧，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，用相應(yīng)的電極組成膽固醇傳感器測(cè)定電流的變化量，在一定條件下，電流變化量與膽固醇濃度呈線性相關(guān)。2021/5/950(4）肌酸和肌酸酐電極

脫水肌酸肌酸酐2021/5/951

血清肌酸肝含量測(cè)定是衡量腎功能的一個(gè)很好的基準(zhǔn)。血清肌酸酐濃度不會(huì)因食物的種類而受影響，所以做為判斷腎臟機(jī)能的依據(jù)較血清尿素可靠。血清肌酸酐濃度與肌肉的量有關(guān)，因此肌肉多的排放的尿肌酸酐濃度會(huì)比肌肉少的多。2021/5/9522021/5/95354

肌酸和肌酸酐微傳感器2021/5/95455（5）磷酸鹽電極

佝僂病軟骨病2021/5/95556葡萄糖-6-磷酸鹽葡萄糖+磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖+O2葡萄糖酸+H2O2葡萄糖氧化酶2021/5/95657（6）淀粉電極

淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖+O2葡萄糖酸+H2O2葡萄糖氧化酶2021/5/95758（7）乙醇電極

CH3CH2OH?可用乙醇來(lái)制造醋酸、飲料、香精、染料、燃料等。?醫(yī)療上也常用體積分?jǐn)?shù)為70-75%的乙醇作消毒劑等。2021/5/958酒后駕駛飲酒駕車(chē)：指駕駛員血液中的酒精含量大于或等于20mg/100mL小于80mg/100mL的駕駛行為。350mL(約相稱于1小瓶)啤酒或半兩白酒(20mL)2021/5/959醉酒駕車(chē)：指駕駛員血液中的酒精含量大于或等于80mg/100mL的駕駛行為。

1400mL(約相稱于3瓶500mL)啤酒或一兩半白酒(80mL)2021/5/960C2H5OH+NAD+CH3CHO+NADH醇脫氫酶NADH+[Fe(CN)6]4-NAD++[Fe(CN)6]3-+H++e-2021/5/961（二）電位型酶電極電位型酶電極是將酶促反應(yīng)所引起的物質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變成電位信號(hào)輸出，電位信號(hào)大小與底物濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。

2021/5/962電位型酶電極所用的基礎(chǔ)電極是對(duì)某種離子有選擇性或?qū)怏w有選擇性的電極離子選擇性電極氣敏電極2021/5/9632021/5/964

1773年，伊萊爾·羅埃爾（HilaireRouelle）發(fā)現(xiàn)尿素。1828年，德國(guó)化學(xué)家弗里德里希·維勒首次使用無(wú)機(jī)物質(zhì)氰酸氨（由氯化銨和氯酸銀反應(yīng)制得）與硫酸銨人工合成了尿素。弗里德里?！ぞS勒（FriedrichWohler）⑴尿素電極

2021/5/965尿素的分子模型增高：急性或慢性腎小球腎炎、腎功能衰竭、尿路阻塞、尿路腫瘤、高蛋白質(zhì)飲食等。減低：妊娠后期、蛋白質(zhì)攝入不足、營(yíng)養(yǎng)不良等。2021/5/96667

尿素在脲酶作用下發(fā)生水解反應(yīng)可用氨氣敏電極、二氧化碳電極等作為基礎(chǔ)電極測(cè)定尿素的含量。2021/5/967（2）草酸電極草酸（乙二酸）結(jié)構(gòu)式?

維生素C代謝?甘氨酸代謝?草酰乙酸水解?異檸檬酸降解?食物攝入：菠菜、茶葉

生物體內(nèi)草酸的來(lái)源：2021/5/968草酸

草酸脫羧酶2CO2+甲酸2021/5/969（3）腺苷電極?參與心肌能量代謝?擴(kuò)張血流量?合成ATP、腺苷酸的重要中間體2021/5/970腺苷腺嘌呤脫氨基酶肌苷

+NH32021/5/971（4）苯丙氨酸電極?哺乳動(dòng)物的必需氨基酸

?是甜味劑阿斯巴甜的主要原料2021/5/972苯丙氨酸苯丙氨酸胺裂解酶反式肉桂酸鹽+NH32021/5/9734.2酶場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器(ENFET)

ENFET將酶膜復(fù)合在ISFET的柵極。測(cè)量時(shí)，酶的催化作用使待測(cè)分子反應(yīng)生成ISFET能夠響應(yīng)的離子。

2021/5/974ISFET工作原理2021/5/97576

敏感膜與溶液界面產(chǎn)生膜電位，該電位疊加在柵壓上，引起場(chǎng)效應(yīng)管漏電流的變化。根據(jù)能斯特方程，膜電位的大小與溶液中的離子活度有關(guān)，即:2021/5/976（一）葡萄糖-FET

葡萄糖-FET是由對(duì)H+

敏感的ISFET和固定在其柵極上的葡萄糖氧化酶膜構(gòu)成的。

2021/5/977

酶催化底物反應(yīng)時(shí)，生成葡萄糖酸根、H+

和過(guò)氧化氫，導(dǎo)致酶膜附近pH值變化，且pH的變化量與葡萄糖含量有關(guān)。

溶液中H+的濃度變化，離子敏感膜與溶液界面的膜電位發(fā)生變化，該電位疊加在柵源電壓上，柵源電壓的改變與溶液中pH值的變化量成線性關(guān)系。葡萄糖-FET工作原理：2021/5/978為提高葡萄糖-FET的工作性能和測(cè)量精度，可采用兩個(gè)pH敏感的場(chǎng)效應(yīng)管構(gòu)成差動(dòng)式結(jié)構(gòu)。雙柵極酶-FET傳感器2021/5/979一個(gè)FET的柵極固定葡萄糖氧化酶膜，作為工作FET；另一個(gè)FET的柵極上沒(méi)有酶膜，作為參比FET。將2個(gè)FET接到差動(dòng)放大器上，干擾因素被消除，使輸出電壓只對(duì)葡萄糖響應(yīng)，因此輸出電壓的變化能夠反應(yīng)葡萄糖含量的變化。2021/5/980（二）尿素-FET

尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜組成，其原理是利用pH-FET檢測(cè)脲酶水解尿素時(shí)溶液pH發(fā)生的變化。

2021/5/981↓

↓

＋＋2021/5/982尿素傳感器也可采用差動(dòng)結(jié)構(gòu)，使用兩個(gè)FET，一個(gè)是固定有尿素酶的FET，另一個(gè)則是沒(méi)有固定尿素酶的FET，作為參比FET，利用運(yùn)算放大器組成反饋電路。

Ag/AgCl電極可使溶液的電位保持一定。

2021/5/9832021/5/984

測(cè)定時(shí)由于脲酶催化尿素反應(yīng)時(shí)導(dǎo)致溶液中的pH發(fā)生變化，從而導(dǎo)致溶液-界面上的界面電位改變，經(jīng)差動(dòng)放大器后，輸出電壓與待測(cè)溶液的尿素濃度有關(guān)。

2021/5/985其他應(yīng)用：

青霉素-FET

L-谷氨酸-FET傳感器

2021/5/9864.3酶熱敏電阻傳感器

酶熱敏電阻傳感器是由固定化酶和熱敏電阻組合而成。

用酶熱敏電阻測(cè)定待測(cè)物的含量是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生熱量的多少來(lái)進(jìn)行的。通過(guò)溫度變化推測(cè)待測(cè)物的含量。2021/5/987酶熱敏電阻的基本構(gòu)成密接型柱式反應(yīng)器型2021/5/988酶熱敏電阻的測(cè)溫方式2021/5/989酶熱敏電阻的測(cè)量系統(tǒng)2021/5/990酶載體的特點(diǎn)：

●機(jī)械強(qiáng)度高，耐壓性好；

●固定化效率高；

●化學(xué)及生物學(xué)穩(wěn)定性高。

目前，載體除多孔玻璃以外，還有多糖類凝膠或尼龍制的毛細(xì)管等。2021/5/991優(yōu)點(diǎn)：

容量小、響應(yīng)快、穩(wěn)定性好、使用方便、價(jià)格便宜。

2021/5/992934.4

光纖光學(xué)型酶?jìng)鞲衅?/p>

高錕生于1933年，2009年獲得諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)“光纖之父”2021/5/99394光纖傳感器組成：

光纖生物敏感膜（探頭）光電換能器2021/5/994(c)單束光纖，生物敏感膜與光纖為一體生物敏感膜(a)雙束光纖(b)單束光纖，

生物敏感膜在端部光纖生物傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)換器的三種結(jié)構(gòu)2021/5/995光纖光學(xué)生物傳感系統(tǒng)

2021/5/9961.光纖生物傳感器的特點(diǎn)抗干擾能力強(qiáng)，不受電磁場(chǎng)的干擾；不用參比電極，可以微型化；實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的遙測(cè)；響應(yīng)速度快，靈敏度高。2021/5/9972.光纖酶?jìng)鞲衅鞯墓ぷ髟泶郎y(cè)物質(zhì)從樣品溶液中擴(kuò)散到生物敏感膜時(shí)，在固定化酶的催化下生成一種待檢測(cè)的物質(zhì)；當(dāng)?shù)孜飻U(kuò)散速度與催化產(chǎn)物生成速度達(dá)成平衡時(shí)，即可得到一個(gè)穩(wěn)定的光信號(hào)，依據(jù)光信號(hào)的大小與底物濃度的函數(shù)關(guān)系，得到底物的濃度，一般情況下光信號(hào)大小與底物濃度成正比。2021/5/9983.光纖酶?jìng)鞲衅鞯姆诸?/p>

按照換能器能量轉(zhuǎn)換方式的不同，分為化學(xué)發(fā)光型、光吸收型、熒光猝滅型、指示劑型和生物發(fā)光型。2021/5/999（1）化學(xué)發(fā)光型某些化學(xué)反應(yīng)伴隨光子的釋放，釋放的光子即化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與待測(cè)物的濃度呈線性關(guān)系。但有些生化反應(yīng)不能釋放光學(xué)信號(hào)，需要引入中間物，使其轉(zhuǎn)變成能進(jìn)行光檢測(cè)的信號(hào)。

2021/5/9100

魯米諾（luminol）（3-氨基-鄰苯甲酰肼），又稱發(fā)光氨、光敏靈。在堿性條件下能被許多氧化劑（例如H2O2，ClO-等）氧化而發(fā)出藍(lán)色的光，是研究最早、最多、應(yīng)用最廣泛的發(fā)光試劑。2021/5/9101谷氨酰胺谷氨酸+NH3谷氨酸+O2+H2Oα酮戊二酸+H2O2+NH3魯米諾+H2O2氨基鄰苯二甲酸+N2+hγ谷氨酰胺酶谷氨酸氧化酶2021/5/9102魯米諾+H2O2氨基鄰苯二甲酸+N2+hγ2021/5/9103

GOD氧化葡萄糖，生成的過(guò)氧化氫啟動(dòng)魯米諾電化學(xué)發(fā)光，并通過(guò)光纖傳感器檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。酶促反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，因此傳感器響應(yīng)非?？?。魯米諾+H2O2

氨基鄰苯二甲酸+N2+hγ2021/5/9104（2）光吸收型

如果被測(cè)物A不具有光學(xué)活性，經(jīng)酶催化后產(chǎn)生具有特征光吸收的產(chǎn)物P，或是被測(cè)物A具有特征光吸收特