醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第五部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1范疇GB/T16886的本部分?jǐn)⑹隽嗽u(píng)價(jià)醫(yī)療器械體外細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)辦法。這些辦法規(guī)定了下列供試品以直接或通過擴(kuò)散的方式與培養(yǎng)細(xì)胞接觸和進(jìn)行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）與器械接觸。這些辦法是用對(duì)應(yīng)的生物參數(shù)測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外生物學(xué)反映。2規(guī)范性引用文獻(xiàn)下列文獻(xiàn)中的條款通過GB/T16886的本部分的引用而成為本部分的條款。但凡注日期的引用文獻(xiàn)，其隨即全部的修改單（不涉及勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不合用于本部分，然而，激勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成合同的各方研究與否可使用這些文獻(xiàn)的最新版本。但凡不注日期的引用文獻(xiàn)，其最新版本合用于本部分。GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分：評(píng)價(jià)與實(shí)驗(yàn)（GB/T16886.1-,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分：樣品制備和參考材料（idtISO10993-12:1996）3術(shù)語與定義GB/T16886.1/ISO1993-1中確立的以及下列術(shù)語和定義合用于本部分。3.1陰性對(duì)照材料negativecontrolmaterial按照本部分實(shí)驗(yàn)時(shí)不產(chǎn)生細(xì)胞毒性反映的材料。注：陰性對(duì)照的目的是驗(yàn)證背景反映，例如高密度聚乙烯1）已作為合成聚合物的陰性對(duì)照材料，氧化陶瓷棒則用作牙科材料的陰性對(duì)照物。3.2陽性對(duì)照材料positivecontrolmaterial按照本部分實(shí)驗(yàn)時(shí)可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反映的材料。注：陽性對(duì)照的白目的是驗(yàn)證對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的反映，例如用有機(jī)錫作穩(wěn)定劑的聚氯乙烯2）已用作固體材料和浸提液的陽性對(duì)照，酚的稀釋液用于浸提液的陽性對(duì)照。_____________________________________高密度聚乙烯可從美國藥典委員會(huì)（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和藥品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）獲得。提供這一信息是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。有機(jī)錫聚氯乙烯陽性對(duì)照材料可從SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（產(chǎn)品號(hào)碼499-300-000）獲得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可從Hatano研究所食品和藥品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)獲得。提供這一信息是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。3.3試劑對(duì)照reagentcontrol在不加實(shí)驗(yàn)材料的條件下，按浸提條件和實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)得到的浸提介質(zhì)。注：在本部分中，該定義取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1給出的定義。3.4培養(yǎng)器皿culturevessels合用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，包插玻璃培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)瓶或塑料多孔培養(yǎng)板和微量滴定板等器皿。注，在這些實(shí)驗(yàn)辦法中，這些器皿只要符合組織培養(yǎng)級(jí)別的規(guī)定，并合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)．能夠交換使用。3.5近匯合subconfluency在對(duì)數(shù)生長久末，約80%的細(xì)胞匯合。4樣品制備4.1總則供試品可選用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。樣品制備應(yīng)符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制備4.2.1浸提原則為了測(cè)定潛在的毒理學(xué)危害，浸提條件應(yīng)模擬或嚴(yán)于臨床使用條件，但不應(yīng)造成實(shí)驗(yàn)材料發(fā)生，諸如熔化、溶解或化學(xué)構(gòu)造變化等明顯變化。注：浸提液中任何內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的濃度及其接觸實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的量取決于接觸面積、浸提體積、pH、化學(xué)溶解度、擴(kuò)散率、溶質(zhì)度、攪拌、溫度、時(shí)間和其它因素。4.2.2浸提介質(zhì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè)中應(yīng)使用下列一種或幾個(gè)溶劑。對(duì)浸提介質(zhì)的選擇應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證：a)含血清培養(yǎng)基；b)無血清培養(yǎng)基；c)生理鹽水溶液；d)其它適宜的溶劑。注：溶劑的選擇應(yīng)反映出浸提的目的，并應(yīng)考慮使用極性和非極性兩種溶劑。適宜的溶劑涉及純水、植物油、二甲基亞砜（DMSO）。在所選擇的測(cè)試系統(tǒng)中．如DMSO濃度不不大于0.5%（體積分?jǐn)?shù)），則有細(xì)胞毒性。4.2.3浸提條件lSO10993-12的基本規(guī)定。a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h?？筛鶕?jù)器械特性和具體使用狀況選擇推薦的條件。當(dāng)浸提過程使用含血清培養(yǎng)基時(shí)，只能來用4.2.3.2a）規(guī)定的浸提條件。4.3直接接觸實(shí)驗(yàn)材料的制備4.3.1在細(xì)胞毒性檢測(cè)中，多個(gè)形狀、尺寸或物理狀態(tài)（即液態(tài)或固態(tài)）的材料未經(jīng)修整即可進(jìn)行測(cè)試。固體樣品應(yīng)最少有一種平面。其它形狀和物理狀態(tài)的樣品應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。4.3.2應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)樣品的無菌性。用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)之前，制備實(shí)驗(yàn)材料時(shí)應(yīng)考慮滅菌辦法或滅菌劑對(duì)器械的影響。4.3.3對(duì)液體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)應(yīng)：a）直接附著；或b）附著到含有生物惰性和吸取性的基質(zhì)上。注：濾膜是合用的基質(zhì)。4.3.4對(duì)高吸取性材料，如果可能，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用培養(yǎng)基將其浸透，以防吸取實(shí)驗(yàn)器皿中的培養(yǎng)基。5細(xì)胞系5.1優(yōu)先采用已建立的細(xì)胞系并應(yīng)從承認(rèn)的貯源獲取3）5.2在需要特殊敏感性時(shí)，只能使用直接由活體組織獲取的原代細(xì)胞、細(xì)胞系和器官型培養(yǎng)物，但需證明其反映的重現(xiàn)性和精確性。5.3細(xì)胞系原種培養(yǎng)貯存時(shí)，應(yīng)放在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi)，在-80℃或-80℃下列凍存，培養(yǎng)基內(nèi)加有細(xì)胞保護(hù)劑，如二甲基亞砜或甘油等，長久貯存（幾月至幾年）只能在-130℃或-130℃下列凍存。5.4實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用無支原體污染細(xì)胞，使用前采用可靠辦法檢測(cè)與否存在支原體污染。6培養(yǎng)基6.1培養(yǎng)基應(yīng)無菌。6.2含血清或無血清培養(yǎng)基應(yīng)符合選定細(xì)胞系的生長規(guī)定。注：培養(yǎng)基中允許含有對(duì)實(shí)驗(yàn)無不利影響的抗生素。培養(yǎng)基的穩(wěn)定性與其成分和貯存條件有關(guān)。含谷氨酰胺和血清的培養(yǎng)基在2℃～8℃條件下貯存不超出一周，含谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基在2℃～8℃條件下貯存不超出2周。 6.3培養(yǎng)基的pH值應(yīng)為7.2～7.4。7細(xì)胞原種培養(yǎng)制備7.1用選定的細(xì)胞系和培養(yǎng)基制備實(shí)驗(yàn)所需足夠的細(xì)胞。使用凍存細(xì)胞時(shí)，如加有細(xì)胞保護(hù)劑應(yīng)除去，使用前最少傳代培養(yǎng)一次。7.2取出細(xì)胞，用適宜的酶分散法和／或機(jī)械分散法制備成細(xì)胞懸浮液?！?）推薦的細(xì)胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。這一信息只是為本部分的使用者提供方便，但I(xiàn)SO對(duì)使用該產(chǎn)品不提供擔(dān)保。也可使用其它能得出相似或更佳成果的細(xì)胞系。8實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)8.1平行樣數(shù)最少采用三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)和對(duì)照數(shù)。8.2浸提液實(shí)驗(yàn)8.2.1該實(shí)驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評(píng)價(jià)。8.2.2從持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸浮液中吸取等量的懸浮液，注入浸提液接觸的每只培養(yǎng)器皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)器皿使細(xì)胞均勻地分散在器皿的表面。8.2.3根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5%（體幟分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在37℃士2℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在近匯合單層細(xì)胞或新鮮懸浮細(xì)胞上進(jìn)行。如僅是檢測(cè)克隆形成，應(yīng)采用較低的細(xì)胞密度。8.2.4實(shí)驗(yàn)前用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)狀況。8.2.5實(shí)驗(yàn)可選用：a)浸提原液；和b)以培養(yǎng)基作稀釋劑的系列浸提稀釋液。實(shí)驗(yàn)如果用單層細(xì)胞，應(yīng)棄去培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基，在每只器皿內(nèi)加等量浸提液或上述稀釋液。如用懸浮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞懸浮液制備好后立刻將浸提液或上述稀稀釋液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液時(shí)，浸提液用培養(yǎng)基稀稀后應(yīng)在最高生理相容濃度下實(shí)驗(yàn)。注：建議在稀釋浸提液時(shí)使用濃縮的（如2倍、5倍）培養(yǎng)基。8.2.7加等量的空白試劑和陰性及陽性對(duì)照液至其它平行器血中。注：如需要，還能夠用新新鮮培養(yǎng)基做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。8.2.8器皿按8.2.3中所述同樣條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)符合選定辦法的規(guī)定。8.2.9通過最少24h的培養(yǎng)后，接8.5擬定細(xì)胞毒性反映。8.3直接接觸實(shí)驗(yàn)8.3.1該實(shí)驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評(píng)價(jià)。8.3.2從持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸液中吸取等量的懸浮液，注入與實(shí)驗(yàn)樣品直接接觸的每只器皿內(nèi)。輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)器皿，使細(xì)胞均勻地分散在每只器皿的表面。8.3.3根據(jù)培養(yǎng)基選擇含或不含5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在37℃±2℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)細(xì)胞生長至近匯合。8.3.4實(shí)驗(yàn)前用顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)狀況。8.3.5棄去培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基，加新鮮培養(yǎng)基至各器皿內(nèi)。8.3.6在每只器皿中央部位的細(xì)胞層上各輕輕放置一種實(shí)驗(yàn)樣品，應(yīng)確保樣品覆蓋細(xì)胞層表面約十分之操作時(shí)應(yīng)注意避免樣品不必耍的移動(dòng)，否則可能會(huì)造成細(xì)胞的物理性損傷，這可從被移動(dòng)細(xì)胞的碎片來判斷。注：如可能，在細(xì)胞加入前將樣品放入培養(yǎng)器皿內(nèi)。8.3.7同法制備陰性和陽性對(duì)照材料平行器皿。8.3.9去除上層培養(yǎng)基，接8.5擬定細(xì)胞毒性反映。8.4間接接觸實(shí)驗(yàn)8.4.1瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)注：多個(gè)不同分子量和純度的瓊脂可通用。吸水性材料置于瓊脂之前先用培養(yǎng)基進(jìn)行濕化解決，以避免瓊脂脫水。用活體染色劑如中性紅可有助于檢測(cè)細(xì)胞毒性?；铙w染色劑可在培養(yǎng)前或培養(yǎng)后與樣品一起加入．如在培養(yǎng)前加，應(yīng)在避光條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以防因染色劑光活化作用而引發(fā)細(xì)胞損傷。8.4.2濾膜擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)μm、無表面活性劑的濾膜，并加入等量持續(xù)攪拌的細(xì)胞懸浮液，輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻地分散在每只濾膜的表面。8.5細(xì)胞毒性鑒定8.5.1可來用定性或定量辦法檢測(cè)細(xì)胞毒性。a）定性評(píng)價(jià)：用顯微鏡檢查細(xì)胞（如果需耍，使用細(xì)胞化學(xué)染色）評(píng)價(jià)諸如普通形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和膜完整性等方面的變化，普通形態(tài)的變化可描述性地在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中統(tǒng)計(jì)或以數(shù)字統(tǒng)計(jì)，下列是給實(shí)驗(yàn)材料計(jì)分的有效辦法。細(xì)胞需性計(jì)分含義0無細(xì)胞毒性1輕微細(xì)胞毒性2中度細(xì)胞毒性3重度細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)涉及評(píng)價(jià)辦法和評(píng)價(jià)成果。b）定量評(píng)價(jià)：測(cè)定細(xì)胞死亡、細(xì)胞生長克制、細(xì)胞繁殖或細(xì)胞克隆形成。能夠用客觀的辦法對(duì)細(xì)胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放和還原或其它可測(cè)定參數(shù)進(jìn)行定量測(cè)試，使用的辦法和測(cè)試成果應(yīng)在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中統(tǒng)計(jì)。注：某些檢測(cè)細(xì)胞毒性的特殊辦法，可能需要零點(diǎn)或基線細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照。8.5.2應(yīng)謹(jǐn)慎選擇評(píng)價(jià)辦法，實(shí)驗(yàn)樣品如果釋放對(duì)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或?qū)z測(cè)有影響的物質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)成果可能無效。注：評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，釋放甲醛的材料須通過可靠的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。8.5.3各平行培養(yǎng)皿的檢測(cè)成果如有顯著差別，則鑒定實(shí)驗(yàn)不當(dāng)或無效。8.5.4陰性、陽性及任何其它對(duì)照物（參考、培養(yǎng)