水酶法提取大豆油脂和蛋白工藝優(yōu)化研究

水酶法提取大豆油脂和蛋白工藝優(yōu)化研究

植物的濾液包括從纖維、半纖維、木質(zhì)素和果膠中收集的油。油存在于油粒細(xì)胞中，通常與其他主枝（蛋白質(zhì)和化合物）結(jié)合，形成脂肪醇和脂肪醇等綜合體。只有破壞油組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和油素結(jié)構(gòu)，才能提出油。水酶法提油技術(shù)是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上,采用對(duì)油料組織以及脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體有降解作用的酶(如纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、葡聚糖酶等)處理油料,通過(guò)酶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞,以及酶對(duì)脂蛋白、脂多糖的分解作用,增加油料組織中油的流動(dòng)性,從而使油游離出來(lái)。與傳統(tǒng)工藝相比,水酶法提油技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作安全、效率高;所得的毛油質(zhì)量高、色澤淺、易于精煉;處理?xiàng)l件溫和,能生產(chǎn)出脫毒的蛋白產(chǎn)品;生產(chǎn)過(guò)程能耗相對(duì)較低;廢水中BOD與COD值大為下降,污染少、易處理。同時(shí),酶的專一性,決定采用單一純酶在酶解工藝中有很大局限性,因此,選擇幾種合適酶混合使用,將會(huì)使細(xì)胞降解更徹底、效果更好,混合酶應(yīng)用商品化愈來(lái)愈受到油脂界關(guān)注。近些年相關(guān)專家已經(jīng)利用復(fù)合酶水解法從葵花籽、菜籽、芝麻、玉米胚芽等油料作物中成功提取油脂。大豆細(xì)胞壁的主要組成成分是纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì),因此實(shí)驗(yàn)中多選取纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶水解后,再利用蛋白酶水解提取大豆油脂。例如,Rosenthal等采用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶作用于121℃處理8min的大豆,發(fā)現(xiàn)纖維素酶與蛋白酶作用效果較好,采用響應(yīng)面分析方法對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,油得率為58.7%,而不用酶處理的油得率僅為41.8%。但假如大豆粉不經(jīng)熱處理,加酶后的體系油得率反而低于不加酶作用的體系。張巖春等采用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)學(xué)方法優(yōu)化纖維素酶、果膠酶和蛋白酶在提取大豆油時(shí)的配比,得出結(jié)論:以纖維素酶占32.95%、果膠酶占47.86%、蛋白酶占19.32%的配合比時(shí)復(fù)合酶的破壁能力最強(qiáng),有利于油脂從油料組織中釋放。鑒于不同的實(shí)驗(yàn)方案及數(shù)據(jù)處理方法得到的復(fù)合酶配比和水解條件的不同,本實(shí)驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì)的數(shù)學(xué)方法研究復(fù)合酶(纖維酶、半纖維酶、果膠酶)配比對(duì)水酶法提取大豆油脂的影響規(guī)律,并且對(duì)最適合水酶法提取大豆油脂復(fù)合酶配比和水解條件進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)對(duì)該法提取的大豆油脂品質(zhì)的研究,進(jìn)一步指導(dǎo)對(duì)大豆油脂提取方法的選擇。1材料和方法1.1酶:單次酶活2.大豆為黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院培植的墾農(nóng)42(蛋白質(zhì)含量41.6%、油脂含量21.3%、含水率10.6%、灰分4.3%)。纖維素酶(酶活1.5×104U/g)、半纖維素酶(酶活1.5×103U/g)、果膠酶(酶活5×104U/g)美國(guó)Sigma公司;Alcalase2.4L堿性蛋白酶(酶活1.2×105U/mL)丹麥Novo公司。1.2儀器、檢測(cè)方法F2102型植物試樣粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司;LDZ5-2型臺(tái)式低速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;KDN-04Ш型蛋白質(zhì)測(cè)定儀上海纖檢儀器有限公司;JJ-1型精密電動(dòng)攪拌機(jī)江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;HWS-12型電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;PHS-3C酸度計(jì)上海鵬順科學(xué)儀器有限公司。1.3粗蛋白質(zhì)的測(cè)定水分的測(cè)定:依據(jù)GB/T14489.1—2008《油料水分及揮發(fā)物含量測(cè)定》;粗蛋白的測(cè)定:依據(jù)GB/T14489.2—2008《糧油檢驗(yàn):植物油料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定》;灰分測(cè)定:依據(jù)GB/T5505—2008《糧油檢驗(yàn):灰分測(cè)定法》;大豆油品質(zhì):依據(jù)GB1535—2003《大豆油》;粗脂肪:GB/T5512—2008《糧油檢驗(yàn):糧食中粗脂肪含量測(cè)定》中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定;大豆油脂的品質(zhì)鑒定:依據(jù)GB1535—2003《大豆油》。1.4采用水酶法提取大豆油的過(guò)程1.5堿性蛋白酶最優(yōu)酶解實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所用纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶均為Sigma公司生產(chǎn),通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定3種酶聯(lián)合作用的最佳pH5、最佳酶解溫度37℃,故本實(shí)驗(yàn)研究中,酶解溫度和酶解pH值固定為此參數(shù)。在纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶不同配比條件下水解后,在最優(yōu)條件下利用堿性蛋白酶再次水解,考察總油提取率。在模糊評(píng)判優(yōu)化的堿性蛋白酶最優(yōu)酶解條件下進(jìn)行酶解,即酶解工藝參數(shù)為加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3.6h、料水比1:6、酶解pH9.26。根據(jù)前人的研究,實(shí)驗(yàn)原料的粒度采用錘片式粉碎機(jī)過(guò)3mm篩板的處理方式[9,10,11,12,13,14,15]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在各種酶的最佳加酶量和酶解時(shí)間下(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶的最佳加酶量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.5%、1%,最佳酶解時(shí)間均為1h),通過(guò)混料設(shè)計(jì)法進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化。以A(纖維素酶添加量)、B(半纖維素酶添加量)、C(果膠酶添加量)、D(復(fù)合酶水解時(shí)間)分別代表的因素為自變量,以總油提取率為因變量,其因素水平編碼表見表1。2結(jié)果與分析2.1混料設(shè)計(jì)結(jié)果分析應(yīng)用混料設(shè)計(jì)法進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化,混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件DesignExpert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,建立回歸模型如下:回歸與方差分析結(jié)果見表3,交互作用的等高線分析圖見2,混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果見圖3。由表3可知,方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯,該模型回歸顯著(P<0.001),失擬項(xiàng)不顯著,并且該模型R2=93.19%,R2Adj=84.35%,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著,可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為AB>AC>BC,即纖維素酶與半纖維素酶混合作用水解>纖維素酶與果膠酶混合作用水解>半纖維素酶與果膠酶混合作用水解。由圖1分析結(jié)果可看出,A(纖維素酶添加量)、B(半纖維素酶添加量)、C(果膠酶添加量)、D(復(fù)合酶水解時(shí)間)的交互作用對(duì)總油提取率的影響。由圖1a和圖1b中可以看出當(dāng)纖維素酶和半纖維素酶添加按照1:1配比添加附近有較大值出現(xiàn),說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)中添加果膠酶對(duì)總油提取率影響不大。由圖1b、1c和圖1d可以看出當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),總油提取率反而下降,分析原因是水解pH值在酸性條件下,水解時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性不利于后期蛋白酶水解蛋白質(zhì),從而影響油脂釋放。由圖2可知,纖維酶素與果膠酶共同水解作用對(duì)總油提取率的提高不明顯,半纖維素酶與果膠酶的共同水解作用對(duì)總油提取率的提高不明顯。通過(guò)混料設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化可知當(dāng)復(fù)合酶酶解時(shí)間大于0.33水平即45min時(shí),果膠酶添加量為0.004(添加量較小對(duì)油脂提取率影響不顯著,可化簡(jiǎn)為0),纖維素酶添加量水平值0.419,半纖維素酶添加量水平值0.266,此時(shí)總油提取率有較大值在81.15%左右。根據(jù)因素水平編碼表(表1)換算,得到最優(yōu)復(fù)合酶水解工藝為纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%,兩種酶在pH5條件下復(fù)合水解45min后,再利用堿性蛋白酶在最優(yōu)條件下水解3.6h,可使總油提取率達(dá)到81.15%左右。2.2最優(yōu)復(fù)合酶配比水解條件下提取率的確定通過(guò)對(duì)復(fù)合酶(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶)不同配比水解工藝參數(shù)對(duì)各考察指標(biāo)影響的混料實(shí)驗(yàn)研究,得到了總油提取率提取率的優(yōu)化值。在兩個(gè)考察指標(biāo)最優(yōu)的復(fù)合酶水解工藝條件下,進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取平均值,結(jié)果見表4。由表4可知,在最優(yōu)復(fù)合酶水解條件下各考察指標(biāo)的驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在合理范圍內(nèi),說(shuō)明響應(yīng)值的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好。兩個(gè)考察指標(biāo)均可在混料設(shè)計(jì)優(yōu)化的復(fù)合酶配比水解工藝條件下,得到較大的提取率。由此結(jié)果可以看出,在纖維素酶添加量為0.84%時(shí),總油提取率達(dá)到極大值即81.04%,比以往國(guó)內(nèi)研究采用濕熱處理工藝有很大提高。最終確定最優(yōu)復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油脂工藝條件為料水比1:6、纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后,再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶,加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h。2.3復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油脂的最優(yōu)工藝水酶法制取工藝和傳統(tǒng)工藝相比,得到的油沒(méi)有溶劑殘留且工藝條件溫和,并能保持良好的品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)復(fù)合酶水解水酶法提取工藝(最優(yōu)參數(shù)條件下制取油脂),蛋白酶水解水酶法工藝及傳統(tǒng)溶劑萃取工藝得到的大豆油脂品質(zhì)進(jìn)行了比較和分析,其結(jié)果見表5。通過(guò)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GB1535—2003《大豆油》中大豆油品質(zhì)等級(jí)指標(biāo)對(duì)比研究可知,復(fù)合酶水解水酶法提取的大豆油無(wú)需精煉即可達(dá)到二級(jí)大豆油的標(biāo)準(zhǔn)。由表6可知,復(fù)合酶水解水酶法、蛋白酶水解水酶法及溶劑浸出工藝制取的大豆油脂中脂肪酸組成接近(復(fù)合酶水酶法的油酸含量略高),大豆油中VE含量差異不顯著(溶劑浸出法的VE含量略高),結(jié)果表明不同的制取工藝對(duì)所得大豆油中脂肪酸組成及大豆油中VE含量影響不顯著。3混料混料設(shè)計(jì)優(yōu)化大豆細(xì)胞壁的主要組成成分是纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)研究了纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶水解后,再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶水解提取大豆油脂工藝。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同的復(fù)合酶(纖維酶、半纖維酶、果膠酶)配比水解工藝條件對(duì)后期Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶的水酶法提取大豆油脂的提取率影響較大。本實(shí)驗(yàn)利用混料優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)最適合水酶法提取大豆油脂復(fù)合酶配比和水解條件進(jìn)行優(yōu)化。確定最優(yōu)復(fù)合酶水解水酶法提取大豆油脂工藝條件為料水比1:6、纖維素酶添加量0.84%、半纖維素酶添加量0.4%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后,再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶,加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解p