egcg對高脂性脂肪肝大鼠的治療作用

egcg對高脂性脂肪肝大鼠的治療作用

隨著人類生活水平的提高和飲食結構的變化，以及臨床b超技術的進步和應用，高脂性肝豆的檢出率不斷提高，發(fā)病率和發(fā)病率顯著增加。高脂性脂肪肝屬于非酒精性脂肪肝最常見的一種,如果沒有得到及時的治療很可能逐漸發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、末期肝衰竭以及肝癌。高脂性脂肪肝發(fā)病機制至今尚未完全明確,目前治療主要以祛除病因及誘因和調整飲食為主,藥物僅起輔助治療作用且尚缺乏理想的治療藥物。臨床治療常用的調血脂藥貝特類、他汀類等雖然降血脂效果明顯,但易引起肝損傷。因此研發(fā)既能降血脂,又能對肝臟具有一定保護作用的藥物具有積極的臨床價值。近半個世紀以來,國內外學者相繼開展了調血脂、抗脂肪肝藥物的研究,特別是近20年來通過動物實驗和藥理學研究,已篩選出一批有效的保肝調脂抗氧化作用的藥物。研究表明從綠茶中提取的茶多酚(teapolyphenol,TP)單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallcatechingallate,EGCG)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老等多方面作用。近年來,也有文獻報道茶多酚以及EGCG對神經細胞損傷、糖尿病大鼠腎臟以及大鼠酒精性肝損傷都具有一定的保護作用。此外,研究還發(fā)現(xiàn)EGCG也具有一定調血脂、抗肥胖的作用。本實驗室研究表明EGCG能夠抑制大鼠心肌肥厚膠原生成和細胞增殖,其作用機制可能與其抗氧化作用有關。但是EGCG對大鼠高脂性脂肪肝的治療作用還未見報道。因此,本文應用脂肪乳劑灌胃的方法建立高脂性脂肪肝大鼠模型,研究EGCG對高脂性脂肪肝的治療作用并初步探討其作用機制。1材料和方法1.1大學實驗動物中心供應SD大鼠,♂,體重160～180g,清潔級,蘇州大學實驗動物中心供應[實驗動物生產許可證號:XCYK(蘇)2002-0008,使用許可證號:SYXK(蘇)2002-0037]。實驗期間飼養(yǎng)室溫度(20±2)℃。1.2藥物、試劑和儀器EGCG,純度95%,杭州禾田生物技術有限公司提供,批號:20071123S。非諾貝特(Fenofibrate)膠囊,法國利博福尼制藥有限公司提供,批號:90052,規(guī)格為200mg/粒,進口藥品注冊證號:H20050004,臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制1%的藥物濃度。膽固醇和3號膽鹽,上?？笊锛夹g有限公司提供,批號:20070712。丙基硫氧嘧啶,蘇州東瑞制藥有限公司提供,批號:071011004。各指標檢測試劑盒,均由南京建成生物工程研究所提供。1.3方法1.3.1大鼠肝臟改善模型將SD大鼠隨機分為兩組,即正常對照組和造模組,造模組大鼠每天上午8:00～9:30灌服脂肪乳劑10ml·kg-1·d-1,正常對照組灌服等體積的蒸餾水。連續(xù)灌服脂肪乳劑4wk后隨機取大鼠3只,病理檢查見肝組織中充滿彌散性脂質空泡時,提示高脂性脂肪肝已經形成。此后繼續(xù)灌服脂肪乳劑2wk,并將已形成的脂肪肝大鼠隨機分成EGCG10、20和40mg·kg-13個劑量組以及非諾貝特20mg·kg-1組和脂肪肝模型組,每組大鼠10只,并開始給藥,各給藥組于每天下午2:00～3:30按不同劑量以2ml·kg-1體重灌胃,正常對照組和脂肪肝模型組給予等體積蒸餾水。連續(xù)給藥6wk后,于處理前12h禁食,不禁水,然后以4%水合氯醛10ml·kg-1體重腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,檢測各項指標,取肝臟稱重后分別用冰生理鹽水和三氯甲烷:甲醇(1∶1)混合液制成10%勻漿,供肝組織SOD、MDA和肝脂質測定,另取同一部位兩塊肝臟分別以10%福爾馬林溶液和4%戊二醛溶液固定,分別用光鏡和電鏡檢查肝組織的形態(tài)學改變。1.3.2酶活性的測定按試劑盒提供的方法測定,即血清TC采用膽固醇氧化酶-PAP法測定,TG采用磷酸甘油氧化酶-PAP法測定,HDL-C采用磷鎢酸鎂(PTA-Mg++)沉淀法測定,LDL-C按下列公式計算,LDL-C=TC-(TG/2.2+HDL-C),ALT采用賴氏法測定,AST和FFA采用比色法測定。肝系數(shù)=肝重(g)/鼠重(100g)。1.3.3肝ct和tg含量的測定每鼠稱取肝組織500mg,加三氯甲烷:甲醇(1∶1)混合液至5ml后勻漿,勻漿液置4℃24h后離心,取上清20μl置另一試管中,室溫放置12h以上,待三氯甲烷和甲醇揮發(fā)后,分別采用膽固醇氧化酶-PAP和磷酸甘油氧化酶-PAP法測定肝中的TC和TG含量。1.3.4在肝組織中，sod、mda和蛋白質含量的測定稱取肝組織200mg,加冰生理鹽水2ml后勻漿,離心取上清,分別按試劑盒方法測定SOD、MDA和蛋白含量。1.4統(tǒng)計處理實驗數(shù)據以xˉ±sxˉ±s表示,顯著性檢驗采用One-wayANOVA,對肝臟的病理學檢查結果采用等級資料的秩和檢驗。2結果2.1ecgg對高脂性肝重和肝系數(shù)的影響與正常對照組相比較,高脂性脂肪肝模型組大鼠肝重和肝系數(shù)明顯升高(P<0.01)。連續(xù)給藥6wk后,EGCG能明顯降低高脂性脂肪肝大鼠肝重和肝系數(shù)(P<0.05或P<0.01),并呈劑量依賴性趨勢,但非諾貝特明顯升高高脂性脂肪肝大鼠的肝重和肝系數(shù)(P<0.01)。給藥各組的大鼠體重差異未見顯著性(Tab1)。2.2降低高脂性肝胰腺大鼠血清tc、tg、ldl-c、ffa水平與正常對照組相比較,脂肪肝模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C明顯升高(P<0.05或P<0.01)。連續(xù)給藥6wk后,EGCG能明顯地降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA的水平(P<0.05或P<0.01),同時對血清HDL-C有一定的升高作用(P<0.05)。非諾貝特也能明顯降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量(P<0.05或P<0.01),但對HDL-C未見明顯升高作用(Tab2)。2.3升降p>0.05與正常對照組相比較,脂肪肝模型組大鼠血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.05)。連續(xù)給藥6wk后,EGCG可以降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05或P<0.01),但非諾貝特對ALT和AST的影響無統(tǒng)計學意義(見Tab3)。2.4ecgg對大鼠肝組織中tc、tg、mda含量的影響與正常對照組相比較,高脂性脂肪肝模型組大鼠肝組織中TC、TG和MDA明顯增加(P<0.05或P<0.01),SOD明顯降低(P<0.05)。連續(xù)給藥6wk后,EGCG能明顯地降低高脂性脂肪肝大鼠肝組織中TC、TG和MDA含量(P<0.05或P<0.01),升高SOD水平(P<0.05或P<0.01)。非諾貝特明顯地降低肝組織中TC、TG和MDA含量(P<0.05或P<0.01),但是對SOD影響無統(tǒng)計學意義(Tab4)。2.5ecgg對大鼠肝臟超微結構的影響大鼠肝臟石蠟切片并行HE染色,光鏡下觀察其病理組織學變化。正常對照組肝細胞排列呈索狀,結構正常。模型組可見彌漫性的脂質空泡,并有融合現(xiàn)象,給予EGCG治療6wk后,肝細胞脂質變性的程度明顯減輕,肝細胞結構趨于正常(Tab5、Fig1A～F)。電子顯微鏡下觀察可見正常對照組肝細胞結構正常,而高脂性脂肪肝模型組大鼠肝細胞超微結構明顯改變,肝細胞線粒體腫脹、染色質邊聚和空泡變性,并且充滿大小不等的脂滴等。連續(xù)給藥6wk后,EGCG能明顯地改善肝細胞的線粒體腫脹、染色質邊聚、空泡變性和脂滴。非諾貝特對大鼠肝臟的病理組織學變化的影響基本上與EGCG作用相似(Fig2A～F)。3ecgg對高脂性肝臟大鼠肝臟的抗氧化作用非酒精性脂肪肝是由多種病因引起的肝臟脂肪變性,而高脂血癥是其最常見的病因之一。高脂血癥是指血漿中的TC或(和)TG水平升高,使脂質代謝紊亂的一種常見病,特別是高TG血癥與脂肪肝有密切關系。高脂血癥是形成高脂性脂肪肝的基礎,而肝臟的脂肪病變又影響脂質代謝,從而加重高脂血癥形成惡性循環(huán)。實驗研究表明高脂性脂肪肝大鼠伴隨著脂質代謝紊亂,血脂升高以及肝臟的脂質聚集。本實驗應用脂肪乳劑灌胃的方法建立高脂性脂肪肝大鼠模型,能夠明顯升高大鼠的血脂,增加肝臟脂質聚集,從而逐漸形成高脂性脂肪肝。肝臟在脂類的消化、吸收、分解、合成及運輸?shù)冗^程中起著重要作用,是內源性血脂和脂蛋白合成及其代謝的主要器官,肝外組織的TC主要由HDL攜帶,通過HDL受體途徑進入肝臟代謝。長期攝入高脂飲食,外源性脂肪吸收增加,導致高脂血癥。當高脂血癥形成后,肝臟攝取脂肪酸及其酯化作用增強,肝內脂肪酸除部分合成磷脂和膽固醇外,主要合成TG,TG再與肝細胞粗面內質網上合成的載脂蛋白結合,形成VLDL-TG釋放入血,當肝內TG過多超過了肝臟的轉運能力,或者VLDL分泌障礙時,均可導致TG在肝內質網堆積,從而壓迫肝血竇逐漸造成缺血、變性、壞死。因此,降低血脂、清除肝臟中堆積的脂肪、增加肝臟的抗氧化能力是治療脂肪肝的重要方法之一。本實驗研究顯示,在給予EGCG治療6wk后,高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA明顯降低,并且肝組織中的TC和TG也明顯下降。這些結果表明,EGCG通過降低血脂以及肝臟脂質的含量可能對高脂性脂肪肝大鼠具有一定的治療作用。本實驗中還發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的血清ALT和AST水平明顯升高,在給予EGCG治療6wk后,高脂性脂肪肝大鼠血清ALT和AST水平明顯降低。此結果表明,EGCG不僅對高脂性脂肪肝大鼠肝臟沒有毒性作用,反而具有一定的保肝作用。在給予E