靶蛋白質(zhì)組學(xué)研究的臨床應(yīng)用

靶蛋白質(zhì)組學(xué)研究的臨床應(yīng)用

紅茶的前處理[（-）-非茶素類(lèi)化合物[（-）-peggalechingana鐵粉素，ecgg]是綠茶中最重要的可溶性活性成分。因其特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu),EGCG具有非常強(qiáng)的抗氧化活性,能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA免受損害,并有抗輻射和紫外線(xiàn)等生物學(xué)功能。近年來(lái),大量實(shí)驗(yàn)證明EGCG能干擾癌細(xì)胞生存所需的信號(hào)傳遞。EGCG也能抑制多種酶的活性,并和抗氧化劑相互作用,降低某些致癌物質(zhì)的活力、清除自由基、減輕對(duì)心臟的毒性。此外,它是腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑,能夠提高癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明EGCG對(duì)多種腫瘤有抑制效應(yīng)。通過(guò)對(duì)EGCG抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)EGCG與體內(nèi)許多靶分子可直接相互作用,包括血清白蛋白(serumalbumin,AS)、細(xì)胞膜上的脂筏(membranelipidraft)成分、胞漿中的波形蛋白(vimentin)、酪氨酸蛋白激酶、凋亡調(diào)節(jié)子Bcl-2、分子伴侶蛋白等;胞核中的DNA、RNA、DNA甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶等;異源蛋白質(zhì)單純皰疹病毒編碼蛋白質(zhì)和細(xì)菌DNA促旋酶等。本文綜述了EGCG與不同靶分子直接結(jié)合作用分子機(jī)制,希望為腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療提供新思路。1.ecgg與hsa人血清白蛋白(humanserumalbumin,HAS)是血液中最豐富的血清蛋白,也是最重要的藥物載體蛋白質(zhì)。研究人員利用熒光光譜、圓二色性、傅立葉變換紅外光譜分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接模擬軟件(Dock),對(duì)EGCG與HSA進(jìn)行結(jié)合研究,發(fā)現(xiàn)EGCG能使HAS攜帶的熒光猝滅,同時(shí)軟件預(yù)測(cè)HAS的數(shù)個(gè)氨基酸殘基與EGCG形成特異結(jié)合,并表明EGCG結(jié)合殘基位于HAS的子域IIA和第IIIA部分;通過(guò)各種參數(shù)計(jì)算方程證明除了基本的疏水締合,EGCG與HAS還以范德華力和氫鍵結(jié)合。當(dāng)EGCG通過(guò)HAS運(yùn)送到靶細(xì)胞時(shí),正常細(xì)胞基本上不與EGCG發(fā)生接觸,而脂筏被認(rèn)為是這一過(guò)程的信號(hào)處理中心,并且通過(guò)內(nèi)吞作用使EGCG進(jìn)入細(xì)胞。2.ecgg與socracekide的相互作用脂筏是細(xì)胞膜上具有特殊功能的區(qū)域,通過(guò)動(dòng)態(tài)聚集、募集及靶向運(yùn)輸作用為蛋白質(zhì)分子提供功能平臺(tái),調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與凋亡異常、侵襲轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)等因素密切相關(guān),而脂筏在上述正常和異常情況下均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。脂筏大約包含250個(gè)蛋白質(zhì),其中層粘連蛋白受體(lamininreceptor,LamR)、FAS(factorassociatedsuicide)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(hepatocytegrowthfactorreceptor,HGFR)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(insulin-likegrowthfactorreceptor,IGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)、絲裂原活化蛋白激酶P38(proteasomesubunitp38)、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinaseplasminogenactivator,uPA)和泛素激活酶E1(ubiquitin-activatingenzymeE1)等能與EGCG相互作用,而LamR、IGFR與EGCG的直接結(jié)合已經(jīng)被證實(shí)。2.1肌球蛋白磷酸酶抑制劑活性的變化使用表面等離子體共振證明茶多酚成分中僅EGCG在腫瘤細(xì)胞中與67LR(67-kDalamininreceptor)相互結(jié)合(結(jié)合力Kd=39.9nM),并能影響67LR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。真核翻譯延伸因子1A(eukaryotictranslationelongationfactor1A,eEF1A)是EGCG靶向并共同抗腫瘤活性的成分之一,通過(guò)eEF1A和67LR,EGCG誘導(dǎo)肌球蛋白磷酸酶靶亞單位1(myosinphosphatasetargetingsubunit1,MYPT1)去磷酸化并激活肌球蛋白磷酸酶,使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制;而當(dāng)沉默67LR后,EGCG不能誘導(dǎo)eEF1A或MYPT1導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,這說(shuō)明EGCG的抑癌作用是通過(guò)直接結(jié)合67LR來(lái)調(diào)控eEF1A和MYPT1。2.2ecgg抑制劑胰島素樣生長(zhǎng)因子-I受體(insulin-likegrowthfactor-Ireceptor,IGF-IR)是酪氨酸受體激酶家族成員之一,能促有絲分裂、抗凋亡及轉(zhuǎn)型,在許多腫瘤中高表達(dá)。EGCG是IGF-IR小分子抑制劑(IC50=14mM),能抑制其激酶活性。EGCG能破壞IGF-IR所引起的錨依附式細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng),通過(guò)抑制IGF-IR下游信號(hào),阻礙人類(lèi)乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞表型的表達(dá)。用Dock軟件預(yù)測(cè),EGCG可能結(jié)合在IGF-IR的ATP結(jié)合域,并在其GLN977等五個(gè)氨基酸殘基中形成氫鍵結(jié)合。3.egcg與各種紙漿蛋白質(zhì)的結(jié)合3.1ecgg對(duì)cd3的表達(dá)ζ鏈相關(guān)的70-kDa蛋白(ζchain-associated70-kDaprotein,ZAP-70)是Syk(脾酪氨酸激酶)家族酪氨酸激酶,在白血病中ZAP-70高水平表達(dá)。Dock軟件預(yù)測(cè)EGCG結(jié)合在ZAP-70的ATP結(jié)合域(Kd=620.7nM),并通過(guò)不同的ZAP-70突變體與EGCG的牽出(pull-down)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該預(yù)測(cè)。經(jīng)EGCG處理后,以劑量依賴(lài)方式抑制CD3誘導(dǎo)的AP-1和IL-2的活性;同時(shí)EGCG能劑量誘導(dǎo)胱天蛋白酶(caspase)介導(dǎo)的凋亡。當(dāng)EGCG處理ZAP-70缺陷的細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)凋亡抑制,這說(shuō)明EGCG與ZAP-70的結(jié)合,是其抗CD3陽(yáng)性T細(xì)胞白血病的關(guān)鍵機(jī)制之一。3.2聚體的組合Bcl-2家族是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子,在其表面的疏水性溝能結(jié)合促凋亡BH3域,其二聚體結(jié)合對(duì)調(diào)節(jié)凋亡至關(guān)重要。Dock軟件模擬、核磁共振和熒光偏振實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)因EGCG具有獨(dú)特的gallate基團(tuán)(圖1,C環(huán)),能與Bcl-2、Bcl-xL的疏水域緊密地結(jié)合,有效抑制抗凋亡Bcl-2家族成員,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。3.3ecgg與grp鋼腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗作用是影響腫瘤療效最主要的因素。分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucoseregulatedprotein78,GRP78)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞藥物抵抗。EGCG能直接結(jié)合在GRP78的ATP結(jié)合位點(diǎn),抑制ATPase活性。EGCG能使其有活性的單體轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的二聚體或寡聚體,干擾抗凋亡GRP78-胱天蛋白酶-7復(fù)合體的形成,促進(jìn)依托波苷(etoposide)在腫瘤中的誘導(dǎo)凋亡作用。另外,EGCG能通過(guò)結(jié)合熱休克蛋白HSP90阻斷芳香烴受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)潛在致癌物2,3,7,8-四氯苯二噁英的生成。4.ecgg與核內(nèi)分子的結(jié)合4.1子兒茶素結(jié)合dna寡核苷酸的機(jī)理表面等離子體共振分析表明EGCG、表沒(méi)食子兒茶素[(-)-epigallocatechin,EGC]、表兒茶素沒(méi)食子酸酯[(-)-epicatechingallate,ECG]和沒(méi)食子兒茶素[(-)-epicatechin,EC]這四種兒茶素能結(jié)合到DNA寡核苷酸。冷噴霧電離質(zhì)譜分析表明,1～3個(gè)EGCG分子結(jié)合到單鏈DNA和RNA的18mer上。1～2個(gè)EGCG分子結(jié)合到各種核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈寡核苷酸上。高溫時(shí)能檢測(cè)到dsDNA寡核苷酸與EGCG的結(jié)合,低溫時(shí)能檢測(cè)到兩者形成自由和結(jié)合兩種形式,說(shuō)明EGCG保護(hù)雙鏈DNA,防止其熔解成單鏈。EGCG的C和D環(huán)是結(jié)合DNA所必需的(圖1),兩個(gè)基團(tuán)似乎通過(guò)它們的分支側(cè)鏈與DNA結(jié)合。推測(cè)EGCG可通過(guò)飲茶進(jìn)入細(xì)胞與雙鏈DNA和RNA的結(jié)合聚集,這種聚集作用也許在抗腫瘤中發(fā)揮作用。4.2ecgg能促進(jìn)dngt活性的實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化是腫瘤中許多基因沉默的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一。DNA5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)可以使新合成DNA鏈甲基化,以此方式將超甲基化狀態(tài)傳遞給子細(xì)胞。分子模擬研究表明EGCG能在DNMT接觸催化域的Pro1223等五個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵。在核提取物中,EGCG能以劑量依賴(lài)方式、競(jìng)爭(zhēng)性地抑制DNMT活性(結(jié)合常數(shù)Ki=6.89μM)。在多種腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)EGCG能通過(guò)與DNMT的結(jié)合使許多重要的抑癌基因以時(shí)間劑量依賴(lài)方式出現(xiàn)甲基化逆轉(zhuǎn),說(shuō)明EGCG能通過(guò)結(jié)合DNMT防止和逆轉(zhuǎn)抑癌基因沉默。用EGCG的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物研究說(shuō)明EGCG的C和D環(huán)是其抑制活性的重要結(jié)構(gòu)。5.egcg與細(xì)胞外源蛋白質(zhì)的結(jié)合5.1凝膠電泳檢測(cè)hsv蛋白表達(dá)單純皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)。研究表明,EGCG具有比其他兒茶素更強(qiáng)烈的抑制HSV活性。當(dāng)純化的HSV編碼的包封糖蛋白gB和gD與EGCG共同孵后,凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)低分子量gB、gD條帶減少,而出現(xiàn)新的大分子EGCG-gB或-gD復(fù)合體;gB和gD是HSV傳染性所必須的,而EGCG能通過(guò)與gB和gD等結(jié)合導(dǎo)致HSV病毒顆粒失活。EGCG在宮頸酸性pH環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,說(shuō)明其有可能發(fā)展成抗HSV候選藥物。我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)EGCG能與埃巴病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)編碼的潛伏膜蛋白1(latantmembraneprotein1,LMP1)的mRNA及蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制其致瘤活性,并能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子p53,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將證明其與靶蛋白質(zhì)的結(jié)合部位(待發(fā)表)。5.2細(xì)菌膜的x射線(xiàn)衍射細(xì)菌感染與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),例如胃癌和幽門(mén)螺旋桿菌。EGCG-細(xì)菌膜接觸活性研究證明其可以和細(xì)菌膜磷脂雙分子層結(jié)合,引起脂質(zhì)體囊泡內(nèi)容物外泄。通過(guò)X射線(xiàn)衍射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其是使膜溶解變薄。EGCG能通過(guò)膜磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)菌與DNA促旋酶(DNAgyrase)B結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)在其亞單位的ATP結(jié)合位點(diǎn),EGCG通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ATPase來(lái)抑制DNAgyrase,使細(xì)菌死亡。6.ecgg與其他藥物的作用大多數(shù)藥物分子均通過(guò)與生物體內(nèi)的大分子結(jié)合起作用。因而要得到一個(gè)具有良好生物利用度、代謝穩(wěn)定性和低毒性的藥物,首先必須尋找和生物靶分子高度親和性和選擇性結(jié)合的分子,即先導(dǎo)化合物(leadcompound)。文獻(xiàn)報(bào)道EGCG具有分子伴侶結(jié)構(gòu)類(lèi)似性,其有52種構(gòu)型,是其和大量的靶分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。最近提出的Xenohormesis假說(shuō),也許可以解釋EGCG多種生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制。總的來(lái)說(shuō),EGCG能選擇性的結(jié)合多個(gè)腫瘤細(xì)胞靶分子且有高度親和力,從而激發(fā)信號(hào)及代謝通路的瀑布效應(yīng),抑制癌變。在多種動(dòng)物模型中,EGCG對(duì)多種腫瘤,特別是皮膚癌、肺癌、乳腺癌和胃癌抑制效應(yīng)顯著。有報(bào)道每年飲用超過(guò)250g茶葉能減少人群乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn);在臨床實(shí)驗(yàn)中,EGCG與其他抗腫瘤藥物合用,能發(fā)揮協(xié)同作用機(jī)制。雖然EGCG有抑癌效應(yīng),但也有其缺陷:例如EGCG結(jié)構(gòu)原因?qū)е缕浞€(wěn)定性較差、生物利用度較低。針對(duì)EGCG這一缺點(diǎn),目前有研究對(duì)其進(jìn)行分子改造或用納米材料進(jìn)行包裹,以增加分子穩(wěn)定性,使其在體內(nèi)運(yùn)輸途徑中得到保護(hù),提高抗癌活性。對(duì)于腫瘤這一多階段、多功能通路和多病灶的特點(diǎn),腫瘤容易對(duì)單靶藥物耐受,所