酶法提取雞花青素工藝研究

酶法提取雞花青素工藝研究

太和雞，又名絲毛雞、毛雞、白鳳雞、武象山，具有“冠、鳳頭、綠耳、胡子、絲毛、爪、足部、烏皮、烏肉、烏骨”等特點(diǎn)。它的外形是美麗的，有“十完整美”的理論。它發(fā)祥于泰和縣武山汪陂涂村,至今已有2200年歷史。烏骨雞區(qū)別于其他雞的顯著特征是體內(nèi)(特別是骨)黑色素分布廣泛?！侗静菥V目》中記載:烏雞的入藥效果與烏雞皮、骨、肉中的黑色素深淺有關(guān),其顏色愈深者,入藥愈佳?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為烏雞的藥用價(jià)值和食用價(jià)值存在于體內(nèi)黑色素物質(zhì)中,烏雞黑色素是滋補(bǔ)、強(qiáng)身健體、抗衰防老、頤養(yǎng)天年的物質(zhì)基礎(chǔ)。黑色素是一種不溶于水和幾乎所有溶劑的生物高聚體。哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有兩種天然的黑色素,黑-棕色的真黑色素和黃-紅色的脫黑色素。烏雞黑色素屬于真黑色素。真黑色素是一種復(fù)雜的多聚體,由5,6-二羥吲哚和5,6-二羥吲哚-2-羧酸和它們相對應(yīng)的O-醌體雜合而成。桑宏慶等對鹽酸法提取烏雞黑色素的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定在料液比為1∶2(m∶V),40℃條件下浸提3次效果最佳,提取率可達(dá)0.3736%。蔡華珍等研究酶法水解烏雞蛋白質(zhì)分離黑色素,結(jié)果表明,酸性蛋白酶為最優(yōu)水解酶,其加酶量3.8%、固液比1∶2(m∶V);其最佳酶解條件為pH2.8、酶解溫度34.8℃、酶解時(shí)間20h。但是對兩種方法提取工藝優(yōu)化以及比較研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以泰和烏骨雞為原料,用單因素和正交試驗(yàn)比較研究酶法和鹽酸提取法兩種提取方法的最佳工藝、黑色素的提取率以及黑色素的穩(wěn)定性等,以確定最佳的提取烏雞黑色素的提取方法以及工藝條件。1材料和方法1.1試劑和儀器泰和烏骨雞:購于江西省泰和縣烏骨雞原種雞廠,60～90日齡?；铍u運(yùn)輸,養(yǎng)殖于動(dòng)物學(xué)院的動(dòng)物飼養(yǎng)中心。木瓜蛋白酶(酶活力≥100萬U/g)、胃蛋白酶(酶活力1∶3000U/mg)、堿性蛋白酶(酶活力>10萬U/g)、胰蛋白酶(酶活力1000～1500U/mg):上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;DPPH·:美國Sigma公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉:湖州湖試化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、碳酸鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸、濃鹽酸:杭州大方化學(xué)試劑廠。1.2實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī):TD5A-WS,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;紫外光柵分光光度計(jì):752,上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水槽:DK-8D型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司旋渦混合器:VORTEX-5,美國ScientificIndustries公司;移液槍:4860型,德國Eppendorf公司;電子天平:TE412-L,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。1.3測試方法1.3.1提取黑驢的方法(1)液和氧化酶法取經(jīng)預(yù)處理的泰和烏雞腿部肌肉50g,絞碎,置于250mL燒杯中,加入磷酸鹽緩沖液和蛋白酶,在一定條件下,攪拌酶解4h左右。酶解液于90～100℃保溫處理20min,然后于5000r/min離心20min,棄去上清液,先后用石油醚、乙酸、蒸餾水等溶劑多次洗滌下層沉淀去除雜質(zhì),將沉淀真空冷凍干燥得到烏雞黑色素粗品。(2)雞激素的提取取經(jīng)預(yù)處理的泰和烏雞腿部肌肉50g,絞碎,置于250mL圓底燒杯中,加入6mol/L的鹽酸浸泡12h,90～100℃下冷凝回流2～3h,流水冷卻后,提取液于5000r/min離心20min,棄去上清液,先后用石油醚、乙酸、蒸餾水等溶劑多次洗滌下層沉淀,去除雜質(zhì),將沉淀真空冷凍干燥得到烏雞黑色素粗品。1.3.2采用酶法提取烏江黑色素的優(yōu)化(1)蛋白酶種類對雞氧化酶提取率的影響固定酶底比為1∶25(m∶m),料液比為1∶2(m∶V),酶解時(shí)間為4h。以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶為考察對象,分別在各酶最適溫度和pH條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察蛋白酶種類對烏雞黑色素提取效果的影響。各蛋白酶的最適溫度和pH見表1。(2)酶解時(shí)間及ph以木瓜蛋白酶為水解酶,固定酶底比為1∶25(m∶m),溫度為55℃,pH為5.5,酶解時(shí)間為4h。分別在料液比為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6(m∶V)的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察料液比對烏雞黑色素提取效果的影響。(3)酶解黃瓜蛋白酶由于木瓜蛋白酶在pH3～9.5時(shí)穩(wěn)定,超過此范圍,失活較嚴(yán)重,而木瓜蛋白酶的最適pH值為5.7,因此,在本試驗(yàn)中,以木瓜蛋白酶為水解酶,固定酶底比為1∶25(m∶m),酶解時(shí)間為4h,溫度55℃,料液比為1∶2(m∶V)。分別在pH值為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察pH對黑色素提取效果的影響。(4)酶解時(shí)間及酶解時(shí)間固定酶底比為1∶25(m∶m),pH7.0,料液比1∶2(m∶V),酶解時(shí)間為4h。分別在55,60,65,70,75,80℃條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察溫度對黑色素提取效果的影響。(5)酶底比對激素提取率的影響固定溫度65℃,pH7.0,料液比為1∶2(m∶V),酶解時(shí)間4h,分別在1∶100,1∶50,3∶100,1∶25,1∶20,3∶50(m∶m)的酶底比條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察酶底比對黑色素提取效果的影響。(6)時(shí)間對激素提取率的影響固定溫度65℃,pH7.0,料液比為1∶2(m∶V),酶底比為1∶20(m∶m),分別酶解1,2,3,4,5,6h的條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察時(shí)間對黑色素提取效果的影響。(7)雞工況對雞工況的影響在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對酶解效果影響最大的4因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以烏雞黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),進(jìn)一步優(yōu)化烏雞黑色素的法提取工藝。1.3.3優(yōu)化黑驢鹽酸處理(1)提取條件的影響以6mol/LHCl為提取液,固定料液比為1∶2(m∶V),回流提取時(shí)間為2h,分別在60,70,80,90,100℃條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察溫度對黑色素提取效果的影響。(2)回流時(shí)間對激素提取率的影響以6mol/LHCl為提取液,固定料液比為1∶2(m∶V),回流溫度90℃,回流時(shí)間分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5h的條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察回流時(shí)間對黑色素提取效果的影響。(3)料液比的影響以6mol/LHCl為提取液,固定回流溫度90℃,回流時(shí)間2h,分別在料液比為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6(m∶V)的條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),以黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),考察料液比對黑色素提取效果的影響。(4)雞調(diào)解劑酸法提取工藝的優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對酸法提取影響最大的3因素設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn),以烏雞黑色素提取率為評價(jià)指標(biāo),進(jìn)一步優(yōu)化烏雞黑色素的酸法提取工藝。1.3.4提取率的測定按式(1)計(jì)算:R=m1m0×100%(1)R=m1m0×100%(1)式中:R——黑色素的提取率,%;m1——提取的黑色素重量,g;m0——原料的重量,g。1.3.5空白對照試驗(yàn)將酶法與酸法提取的烏雞黑色素粗品分別配成黑色素—Na2CO3溶液,黑色素的濃度分別為0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50mg/mL。DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品用95%乙醇配成1×10-4mol/L的溶液,向DPPH·溶液中加入2mL黑色素—Na2CO3溶液,總體積為4mL,搖勻,于25℃水浴中放置30min后倒入光徑為1cm的比色皿,記錄517nm吸光值為A樣品(用2mL95%乙醇與2mL樣品液調(diào)0點(diǎn),以消除試劑本身顏色的影響),向2mLDPPH·溶液中加2mL相應(yīng)樣品溶劑,記錄吸光值為A空白,即空白對照。抑制率η(%)按式(2)計(jì)算:η=A空白?A樣品A樣品×100%(2)η=A空白-A樣品A樣品×100%(2)計(jì)算出兩種提取方法的黑色素溶液抑制率為50%的濃度(IC50),并進(jìn)行比較。1.3.6含量測定將酶法與酸法提取的烏雞黑色素分別配制成濃度為0.2mg/mL的黑色素-Na2CO3溶液,置于光照培養(yǎng)箱中光照,光照度強(qiáng)為2700Lx,每12h于560nm下測定1次吸光值。1.3.7不同加熱處理對受壓人4h細(xì)胞吸光值的影響將酶法與酸法提取的烏雞黑色素分別配制成濃度為0.2mg/mL的黑色素-Na2CO3溶液,分別經(jīng)25,50,75,100℃加熱處理4h,于560nm下測定吸光值。2結(jié)果和討論2.1酶法提取行業(yè)的確定在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用木瓜蛋白酶為水解酶,固定料液比為1∶2(m∶V),以酶解溫度、時(shí)間、酶底比、pH為試驗(yàn)因子,進(jìn)行3水平4因素正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平取值見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可知,影響酶提取黑色素的主要因素是提取溫度,其次是pH,加酶量,影響最小的是酶解時(shí)間;酶法提取黑色素的最佳工藝為以木瓜蛋白酶為水解酶,pH6.0,酶解溫度65℃,料液比1∶2(m∶V),酶底比為1∶25(m∶m),酶解時(shí)間4h。在最優(yōu)組合條件下,酶法提取黑色素的提取率為0.846%。蔡華珍等采用酸性蛋白酶為最優(yōu)水解酶,加酶量3.8%,pH2.8,溫度34.8℃,酶解時(shí)間20h,得到的黑色素的得率為0.36%。與之相比,本試驗(yàn)的最佳工藝條件縮短了酶解時(shí)間,提高了得率。2.2鹽酸熱回流提取關(guān)于某在單因素的基礎(chǔ)上,以料液比、提取溫度、回流時(shí)間進(jìn)行3水平3因素正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平取值見表4,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。由表5可知,影響鹽酸熱回流提取黑色素的主要因素是提取溫度,其次為提取時(shí)間,影響最小的是料液比;用鹽酸熱回流提取黑色素的最佳工藝為溫度95℃,料液比1∶4(m∶V),時(shí)間2h。在最佳條件下,得到的烏雞黑色素的提取率為0.458%,與游艷華等用鹽酸法提取烏雞黑色素的方法相比,提高了熱回流的溫度,平均提取率提高了36%。2.3酶法與酸法提取的氨基酸性質(zhì)的比較2.3.1酶法和酸法提取的具體抗氧化能力的比較由圖1可知,酸法與酶法提取的烏雞黑色素均有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。酸法提取的黑色素溶液的半抑制濃度為0.16mg/mL,酶法提取的黑色素溶液的半抑制濃度為0.15mg/mL,所以酶法提取的黑色素抗自由基性能略強(qiáng)于酸法提取的黑色素。當(dāng)黑色素濃度在0.05～0.20mg/mL,酶法抑制率明顯高于酸法;濃度在0.1mg/mL時(shí),兩者差異最大,濃度高于0.3mg/mL后,兩者相當(dāng)。該結(jié)果與蔡華珍等對于酶法和酸法提取的烏雞黑色素的抗自由基性能的研究結(jié)果相似。當(dāng)濃度大于0.3mg/mL后,兩者相當(dāng),可能是在較高濃度時(shí),濃度成了主要影響抑制率的因素,這一結(jié)果仍需繼續(xù)研究。2.3.2酶法色譜法提取的雞網(wǎng)絡(luò)安全由圖2可知,經(jīng)光照處理后,酸法提取的黑色素液吸光值下降速率低于酶法黑色素的下降速率。光照48h后酸法黑色素吸光值從最初的0.822降到了0.684,降低了0.138;而同期酶法黑色素液吸光值則減少了0.344。這說明酸法提取的烏雞黑色素光穩(wěn)定性優(yōu)于酶法黑色素。從圖2還可以看出,酸提法色素吸光度明顯大于酶提法,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是:強(qiáng)酸處理能夠?qū)е抡婧谏孛撊ヴ然?容易使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成色素類物質(zhì),導(dǎo)致對光的吸收能力增加。2.3.3酸法提取的色質(zhì)主要指標(biāo)由圖3可知,隨著溫度的升高,酸法提取的黑色素與酶法提取的黑色素的吸光值均下降,但酸法烏骨雞黑色素的下降速率遠(yuǎn)大于酶法提取黑色素的下降速率。強(qiáng)酸提取因使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成色素類物質(zhì),導(dǎo)致吸光值增加,隨著溫度升高,色素類物質(zhì)很快分解而導(dǎo)致吸光值急劇下降。所以,在熱穩(wěn)定方面,酸法提取的黑色素不及酶法提取的黑色素。耐熱性是考查色素開發(fā)利用潛能的一個(gè)重要指標(biāo),酶法提取的烏雞黑色素在25～100℃變化較小,表明烏雞黑色素具有較好的耐熱性。而