微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用

01微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)WEISHENGWUDEJIBENPEIYANGJISHU傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的缺點(diǎn)

菌種差異、雜菌情況不明、發(fā)酵過程的控制缺乏標(biāo)準(zhǔn)等，往往會(huì)造成發(fā)酵食品的品質(zhì)不一。

為了縮短發(fā)酵時(shí)間，確保品質(zhì)穩(wěn)定，工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，通常先通過微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得單一菌種，再將它們接種到物料中進(jìn)行發(fā)酵。

防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物是研究和應(yīng)用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物，一方面要為人們需要的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件；另一方面要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。（一）微生物難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱。1.概念2.微生物的類群（1）無細(xì)胞結(jié)構(gòu)（2）原核細(xì)胞（3）真核細(xì)胞病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌體等DNA病毒細(xì)菌：藍(lán)細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌：鏈霉菌等真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲、變形蟲等3.微生物的結(jié)構(gòu)（一）微生物直徑在30～200nm之間直徑在0.5～5μm之間直徑3～6μm之間～～~

微生物結(jié)構(gòu)簡單、形體微小，眼睛看不到，若想看某種純凈的微生物。我們?cè)撛趺醋?？若想通過肉眼能看到細(xì)菌，我們又該如何？

必須對(duì)其進(jìn)行分離純化；

對(duì)微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，致使其在培養(yǎng)基表面或內(nèi)部形成菌落。不同的細(xì)菌具有不同的菌落。

分散的微生物在適宜的瓊脂固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長，可以形成肉眼可見的菌落。沙門氏菌毛霉菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)（一）微生物2.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物條件（1）提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件?！囵B(yǎng)基（2）確保其它微生物無法混入?！獰o菌技術(shù)（二）培養(yǎng)基的配制2.作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。1.培養(yǎng)基的概念培養(yǎng)基是人們按照微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無瓊脂長有酵母菌菌落盛有液體培養(yǎng)基分離、計(jì)數(shù)、鑒定、保藏等擴(kuò)大培養(yǎng)、用于工業(yè)生產(chǎn)特別提醒(1)固體培養(yǎng)基中的瓊脂僅作為凝固劑，不能為微生物生長提供能量和碳源。(2)病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物，只能在活細(xì)胞中營寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。（二）培養(yǎng)基的配制3.基本成分水、碳源、氮源和無機(jī)鹽①

碳源無機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-等有機(jī)碳源：糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、石油等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物②

氮源無機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機(jī)氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源③

無機(jī)鹽Ca、K、Mg等為大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等為微量元素*一般情況下，不添加氮源培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)_____微生物固氮補(bǔ)充說明：①

含有C、H、O、N的有機(jī)物可作為異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。②

自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。③

自養(yǎng)型微生物所需的碳源來自無機(jī)碳源，異養(yǎng)型微生物所需的碳源來自有機(jī)碳源，因此可以根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。④

無機(jī)氮源不但能給自養(yǎng)型微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學(xué)能）。⑤

無機(jī)鹽除了可以調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，有些無機(jī)鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細(xì)菌）。旁欄思考題：

為什么培養(yǎng)基需要氮源？

培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。（二）培養(yǎng)基的配制4.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000ml水

牛肉膏和蛋白胨來源與動(dòng)物，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基的配制5.培養(yǎng)基的特殊需求

在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對(duì)___、____________以及___的需求；pH特殊營養(yǎng)物質(zhì)O2微生物例子培養(yǎng)基需要的特殊物質(zhì)或條件

乳酸桿菌霉菌細(xì)菌厭氧微生物添加維生素調(diào)至酸性調(diào)至中性或弱堿性提供無氧的條件維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等劃分培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定。微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進(jìn)所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物。在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基的配制4.培養(yǎng)基的類型配制培養(yǎng)基根據(jù)成分劃分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基(1)合成培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。如察氏培養(yǎng)基等。(2)天然培養(yǎng)基：由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯。(3)半合成培養(yǎng)基：在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)上適當(dāng)加入已知成分的無機(jī)鹽類，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分。

1973年，科學(xué)家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。1、實(shí)例：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。尋找耐高溫的DNA聚合酶

篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。選擇培養(yǎng)基美國黃石公園培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出沒有抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?具體處理原理目的選擇培養(yǎng)基加入青霉素青霉素能抑制細(xì)菌生長，對(duì)真菌無作用加入高濃度食鹽金黃色葡萄球菌耐高鹽不加氮源固氮微生物能利用空氣中的氮?dú)獠患佑袡C(jī)碳源自養(yǎng)型微生物能利用無機(jī)碳源鑒別培養(yǎng)基加入酚紅培養(yǎng)基尿素被分解產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基呈堿性，酚紅指示劑變紅。加入剛果紅剛果紅與纖維素能形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被分解后，復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈。拓展練習(xí)：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)微生物鑒別分解尿素的細(xì)菌鑒別纖維素分解菌分離金黃色葡萄球菌金屬光澤的紫黑色1、大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上典型特征

2、纖維素分解菌在剛果紅培養(yǎng)基上典型特征

紅色消失，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈鑒別培養(yǎng)基：2.幾種微生物的營養(yǎng)和能量來源微生物碳源氮源能源藍(lán)細(xì)菌CO2光能硝化細(xì)菌CO2NH3NH3的氧化根瘤菌糖類等有機(jī)物N2有機(jī)物大腸桿菌糖類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物蛋白質(zhì)等有機(jī)物（二）培養(yǎng)基的配制

原則①目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。②營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。細(xì)菌pH為：；放線菌pH為：；真菌pH為：思考：

是否所有培養(yǎng)基都必須添加碳源、氮源？不是；

例如分離固氮菌不需要額外添加氮源，其可以直接利用空氣中的氮?dú)狻?1)用于發(fā)酵的微生物主要指細(xì)菌和真菌(

)(2)培養(yǎng)基中加入瓊脂的目的是提供碳源(

)(3)所有微生物在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中都需加入氮源(

)(4)培養(yǎng)不同微生物的培養(yǎng)基成分完全一樣(

)判斷正誤√×××【基礎(chǔ)過關(guān)】(1)所有的培養(yǎng)基中都要加入瓊脂。()(2)是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源。(

)(3)培養(yǎng)霉菌時(shí)一般需將培養(yǎng)基調(diào)至堿性。(

)(4)培養(yǎng)厭氧型微生物時(shí)，除需要提供無機(jī)碳源之外，還需要提供無氧的條件。(

)××××(5)凡碳源都提供能量。（）(6)除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽。（）(7)無機(jī)氮源也可能提供能量。（）(8)培養(yǎng)基只能用于培養(yǎng)微生物。（）××√×提示：培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供無氧的條件，其碳源的類型要看其同化作用類型，若為自養(yǎng)型則需要提供無機(jī)碳源，若為異養(yǎng)型則需要提供有機(jī)碳源?！镜淅肯卤硎桥Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基的配方，分析回答：注：牛肉膏和蛋白胨來源于動(dòng)物，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì).材料牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水用量5g10g5g20g定容至1000mL(1)根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基，理由是_____________________________________________________________。(2)該培養(yǎng)基中主要提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？屬于有機(jī)物還是無機(jī)物？________________________________________________________。(3)該培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物同化作用類型是_____________，理由是_________________________________________________________。固體該培養(yǎng)基的配方中含有凝固劑瓊脂牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均屬于有機(jī)物異養(yǎng)型微生物該微生物的碳源和氮源是有機(jī)物探討點(diǎn)概述培養(yǎng)基的種類和營養(yǎng)構(gòu)成資料一：配制培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基：稱取去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL。資料二：100g馬鈴薯中含有80g水、2g蛋白質(zhì)、16g碳水化合物，還有維生素、無機(jī)鹽等。核心探討突破重難強(qiáng)化素養(yǎng)結(jié)合提供的資料和教材中的“表1－1

1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成”，分析并回答下列問題：1.按物理性質(zhì)劃分上述兩種培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類。提示由于瓊脂是凝固劑，所以培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基未加凝固劑，是液體培養(yǎng)基。2.分析上述兩種培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成。提示都含有水、碳源、氮源、無機(jī)鹽和維生素等，其中培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基中主要由糖類提供碳源，蛋白質(zhì)提供氮源，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中主要由牛肉膏提供碳源，主要由蛋白胨提供氮源。4.下表是某微生物培養(yǎng)基的成分，請(qǐng)分析該培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)哪種微生物？若除去①，此培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)圓褐固氮菌嗎？編號(hào)①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100mL提示此培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物。圓褐固氮菌雖可以固氮，但其同化作用類型為異養(yǎng)型，培養(yǎng)基中必須提供含碳有機(jī)物，所以該培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)圓褐固氮菌。1.關(guān)于微生物的營養(yǎng)，下列說法正確的是A.同一種物質(zhì)不可能既作碳源又作氮源B.凡是碳源都能提供能量C.除水以外的無機(jī)物僅提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也可能提供能量典題應(yīng)用及時(shí)反饋知識(shí)落實(shí)√2.下列有關(guān)培養(yǎng)基的敘述，正確的是A.微生物的培養(yǎng)都需要提供水、碳源、氮源、無機(jī)鹽，缺一不可B.微生物在固體培養(yǎng)基上生長時(shí)，可以形成肉眼可見的單個(gè)細(xì)菌C.培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性D.培養(yǎng)基只能培養(yǎng)細(xì)菌√（三）無菌技術(shù)1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵：______________2.無菌技術(shù)應(yīng)圍繞________________展開，主要包括消毒和滅菌。*①對(duì)操作的____、操作者的____和____進(jìn)行_____和_____；②對(duì)用于微生物培養(yǎng)的_____、________和______等進(jìn)行_____；*做好消毒滅菌工作后，要注意避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。*為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，許多操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰附近進(jìn)行。防止雜菌污染如何避免雜菌的污染空間衣著手清潔消毒器皿接種用具培養(yǎng)基滅菌思考：

無菌技術(shù)除用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？無菌技術(shù)還能有效避免操作者被微生物感染。2.常用的消毒和滅菌方法（1）消毒①

概念

使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法，殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。類型適用范圍操作方法消毒較為溫和理化生方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）。煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s～1min化學(xué)藥物生物活體、水源等用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線照射紫外線照射30min接種室、接種箱，超凈工作臺(tái)。②

常用的消毒方法損失細(xì)菌DNA資料卡無菌技術(shù)（AsepticTechnique）煮沸消毒巴氏消毒紫外線消毒化學(xué)藥劑消毒2.常用的消毒和滅菌方法（2）滅菌①概念

指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。②滅菌的方法濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌①芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。②孢子細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無性生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。

（2）滅菌原理：高溫蒸汽破壞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)使其變性。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體。基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。對(duì)象：培養(yǎng)基等注：使用后的培養(yǎng)基必須滅菌后才能丟棄，以免污染環(huán)境。①濕熱滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)100kPa、121℃下維持15～30min。高壓蒸汽滅菌鍋2.常用的消毒和滅菌方法操作步驟操作要領(lǐng)加水將內(nèi)層滅菌桶取出，向外層鍋內(nèi)加水，水面與三角形擱架平齊裝鍋將滅菌物品放在滅菌桶中(不要裝得太滿)，加蓋，對(duì)稱固定螺栓加熱排氣加熱滅菌鍋，打開排氣閥，等冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥保溫保壓100kPa、121℃下，保溫保壓15～30min出鍋1.關(guān)閉電源2.壓力表降至“0”點(diǎn)，（溫度下降）打開排氣閥，3.旋開固定螺栓，取出滅菌物品高壓蒸汽滅菌法（最常用）：培養(yǎng)基、玻璃器皿、工作服等（2）滅菌原理：使微生物細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性和

原生質(zhì)干燥等。對(duì)象：耐高溫，需保持干燥的物品，適用于

玻璃器皿

(如試管、培養(yǎng)皿、吸管、注射器)

金屬器具(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌。②干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)160～170℃下加熱2～3h。2.常用的消毒和滅菌方法干熱滅菌箱類型適用范圍操作方法滅菌強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）。灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時(shí)用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等，生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa，溫度121℃,15～30min。常用的滅菌方法（小結(jié)）（2）滅菌③灼燒滅菌：酒精燈火焰灼燒效果：最徹底原理：使微生物燃燒對(duì)象：接種工具如接種環(huán)、接種針，以及接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位。2.常用的消毒和滅菌方法針對(duì)不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺(tái)培養(yǎng)皿.吸管等玻璃器皿耐高溫、需保持干燥接種環(huán)等金屬工具實(shí)驗(yàn)操作者的雙手培養(yǎng)基家庭餐具等生活用品消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法c.化學(xué)藥劑d.紫外線e.灼燒滅菌f.干熱滅菌g.高壓蒸汽滅菌bdecagf(1)獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染(

)(2)滅菌相比消毒對(duì)微生物的殺滅更徹底(

)(3)無菌操作的對(duì)象只要是沒有生物活性的材料(如培養(yǎng)基、接種環(huán)等)都可采用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌(

)判斷正誤√√×3.下列有關(guān)無菌技術(shù)的說法，正確的是A.無菌技術(shù)的關(guān)鍵是殺滅實(shí)驗(yàn)室中的所有的微生物B.培養(yǎng)微生物的試劑和器具都要進(jìn)行濕熱滅菌C.經(jīng)巴氏消毒法處理的食品因微生物未被徹底消滅，不能在常溫下長期

保存D.無菌技術(shù)中，若處理對(duì)象為液體，則只能消毒，不能滅菌典題應(yīng)用及時(shí)反饋知識(shí)落實(shí)√√（三）微生物的純培養(yǎng)

由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。1.概念2.步驟配制培養(yǎng)基滅菌接種分離培養(yǎng)等酵母菌的純培養(yǎng)

分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。微生物群分散或稀釋單個(gè)細(xì)胞繁殖單菌落酵母菌的純培養(yǎng)

目的要求

1.學(xué)會(huì)配制培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基并倒平板。2.學(xué)會(huì)進(jìn)行無菌操作。3.嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。

材料用具

酵母菌培養(yǎng)液、馬鈴薯、葡萄糖(或蔗糖)、瓊脂、蒸餾水、天平、小刀、紗布、燒杯、錐形瓶、棉塞、牛皮紙(或報(bào)紙)、皮筋、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱和恒溫培養(yǎng)箱等。2.步驟（1）制備培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。滅菌

將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min。將5～8套培養(yǎng)皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃滅菌2h。倒平板待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。調(diào)pH倒平板倒平板的具體操作步驟④等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來放置①拔出錐形瓶的棉塞②將瓶口迅速通過火焰③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10-20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。（2）接種和分離酵母菌

通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)過數(shù)次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法平板劃線的具體操作步驟①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)的金屬絲燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并拔出裝有酵母菌的棉塞。③將試管口通過火焰④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液。⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。平板劃線的具體操作步驟12345灼燒接種環(huán)蘸取菌液第1區(qū)接種灼燒接種環(huán)第2區(qū)接種灼燒接種環(huán)第3區(qū)接種第5區(qū)接種注意：①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環(huán)進(jìn)行滅菌④劃線后,培養(yǎng)皿底部做好標(biāo)記，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。酵母菌的純培養(yǎng)

3.培養(yǎng)酵母菌完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃

左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。警示：在實(shí)驗(yàn)室中，切不可吃東西、喝水，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。酵母菌的純培養(yǎng)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長?如果有,說明了什么?2.在接種酵母菌的培養(yǎng)基上,你是否觀察到了單菌落?這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致?如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎?3.你是如何記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的?請(qǐng)與其他同學(xué)交流、互評(píng)。提示1：在未接種的培養(yǎng)基表面應(yīng)該沒有菌落生長，如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染。提示2：如果觀察到了不同形態(tài)的菌落，可能是接種的菌種不純或無菌操作不規(guī)范等原因引起的。（四）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)、分析、思考1.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時(shí)開始倒平板？2.為什么倒平板和接種整個(gè)過程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行？3.倒平板時(shí)為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？4.在倒平板的過程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時(shí)，若低于50℃不及時(shí)操作，瓊脂會(huì)凝固。避免雜菌污染

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

不能；因?yàn)榭諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。5.為什么倒平板時(shí)，將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？6.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？7.怎么確定所倒平板未被雜菌（主要是細(xì)菌）污染？8.未接種的培養(yǎng)基直接培養(yǎng)起什么作用？防止雜菌污染培養(yǎng)基

可避免培養(yǎng)基中的水分過快蒸發(fā)；可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

將未接種的空白培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。

做空白對(duì)照，若培養(yǎng)后培養(yǎng)基表面無菌落，則說明培養(yǎng)基沒有污染。9.若未接種的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)菌落，說明了什么？10.為什么在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？說明培養(yǎng)基被污染，實(shí)驗(yàn)組的菌落中可能存在雜菌。灼燒時(shí)期目的取菌種前每次劃線前接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。殺死上次劃線時(shí)殘留菌種，使下一次劃線