重金屬對貝類毒性效應(yīng)的研究進展

.-.重金屬對貝類毒性效應(yīng)的研究進展摘要本次研究重金屬對貝類毒性效應(yīng)，其中包括鎘和汞對貝類的毒性效應(yīng)。研究表明，鎘對貝類重金屬鎘能夠誘導(dǎo)SOD、CAT、GSH-PX三種氧化酶的活性上升,而脅迫時間超過一定范圍后,三種酶活性均會逐下降。在研究鎘對貝類的毒性影響時，主要著重抗氧化酶系活性的影響和免疫功能的探索。探明了金屬硫蛋白、超氧化物歧化酶和溶菌酶基因的表達對Cd、Hg、弧菌復(fù)合脅迫的響應(yīng)情況；檢測了Cd、Hg導(dǎo)致的血細胞損傷，初步闡明了四角蛤蜊對Cd、Hg脅迫的響應(yīng)機制。關(guān)鍵詞重金屬抗氧化酶系統(tǒng)脅迫免疫AbstractThestudyonthetoxiceffectofheavymetalinshellfish,includingthetoxiceffectsofcadmiumandmercuryonshellfish.Researchshowsthattheriseofshellfish,cadmiumcadmiumcaninduceSOD,CAT,GSH-PXthreekindsofenzymeactivity,andthestresstimeexceedsacertainrange,threekindsofenzymeactivitywilldecline.Inthestudyofeffectsofcadmiumonshellfishtoxicity,exploretheeffectsandimmunefunctionismainlytheactivityofantioxidantenzymes.Provenmetallothionein,superoxideandlysozymegeneexpressioninresponsetoCd,Hg,Vibriocompositestress;detectionofbloodcellinjury,causedbyHgCd,theresponsemechanismoffourtoCd,clamHgstress.KeywordsHeavymetalAntioxidantenzymesystemCoercionImmune1.鎘對貝類毒性效應(yīng)的研究進展1.1鎘脅迫對貝類抗氧化酶系活性的影響取經(jīng)重金屬鎘脅迫實驗后的青蛤血清,用于超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性測定。1.1.1過氧化氫酶過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨中止法,以每毫升血清或每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H202的量為一個活力單位。1.1.2超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性測定原理為:通過使用黃嘌呤/黃嘌吟氧化酶體系生成超氧化物陰離子。加入發(fā)色基團,發(fā)色基團可被由上述體系產(chǎn)生的氧化物陰離子還原成為水溶性的黃色甲染料,這樣SOD活性通過抑制發(fā)生基團的還原來測定。在本反應(yīng)體系中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為一個SOD活力單位。1.1.受到鎘脅迫后,青蛤血清和肝臟中的抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性可在短期內(nèi)達到峰值,這表明Cd在青蛤體內(nèi)富集能對機體造成氧化壓力,同時有大量活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生,這種刺激能使青蛤體內(nèi)迅速合成抗氧化酶,來進行清除和轉(zhuǎn)運活性氧產(chǎn)物。之后隨著暴露時間的延長,抗氧化酶系活力整體逐漸下降,即青蛤清除活性氧、抵御外環(huán)境損傷的能力降低。在個別時間點,實驗組酶活力顯著低于對照組,表明此時抗氧化酶活力受到了抑制。貝類處于對逆境脅迫具有高易感性的不穩(wěn)定狀態(tài),此時機體的免疫系統(tǒng)遭到破壞而易于遭受來自外界的病害。1.1.4谷胱甘肽過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)可以催化GSH產(chǎn)生GSSG,而谷胱甘肽還原酶可以利用NADPH催化GSSG產(chǎn)生GSH,通過檢測NADPH的減少量就可以計算出谷胱甘肽過氧化物酶的活力水平。規(guī)定為每0.1ml血清在37°C反應(yīng)5分鐘,或者每毫克蛋白質(zhì),每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低lumol/L為一個酶活力單位。1.2鎘脅迫對貝類免疫活性的影響1.2.1軟體動物具有體液免疫和細胞免疫功能，體液免疫系統(tǒng)由溶酶體酶，凝集素和抗菌肽等組成。細胞免疫在貝類免疫過程中起著主要作用.血細胞的吞噬作用是整個防御系統(tǒng)最主要的過程，由識別，粘連，攝取，破壞和清除外源細胞等不同階段組成。貝類血細胞在營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，傷口修復(fù)，去除代謝產(chǎn)物或污染物等方面起著重要作用。貝類血細胞可以細分為兩種主要類型：透明細胞和顆粒細胞。顆粒細胞主要負責(zé)吞噬作用，它們又可以分為噬酸性顆粒細胞，噬堿性顆粒細胞和中性顆粒細胞。貝類血細胞可以利用溶酶體酶和呼吸爆發(fā)吞噬外源細胞和顆粒。貝類血細胞對特定刺激的呼吸爆發(fā)反應(yīng)與哺乳動物的噬菌細胞類似。1.2.2鎘對貝類免疫功能貝類血細胞具有多種重要作用，如傷口和貝殼損傷的修復(fù)，消化，排泄以及內(nèi)部防御功能。在細胞免疫反應(yīng)中，血細胞的吞噬作用是抵御病原體和外源物質(zhì)的主要防御措施。因此，對血細胞的毒性作用會潛在地影響這些動物的生存。在Cd污染脅迫下，經(jīng)過弧菌刺激以后，其血細胞數(shù)目會有所增加。血細胞活力的增加或減少與免疫系統(tǒng)的紊亂有關(guān)，或者說是鎘通過毒性效應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。1.3鎘對貝類的細胞毒性效應(yīng)1.3.1在貝類細胞免疫反應(yīng)中，血細胞的噬菌作用是貝類抵御病原體和外來物的主要防御措施。溶酶體在雙殼貝類的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用：激活血細胞的吞噬作用，釋放水解酶類降解外來物質(zhì)。但在鎘等重金屬離子的作用下，會引起貝類消化腺細胞溶酶體的腫脹和溶酶體膜穩(wěn)定性的下降。溶酶體膜的變化可能會導(dǎo)致其內(nèi)部的水解酶類意外釋放到細胞質(zhì)內(nèi)，從而對細胞本身造成損傷。1.3.2過氧化物酶體是細胞質(zhì)內(nèi)常見的細胞器，參與了脂質(zhì)和活性氧自由基的代謝過程。過氧化物酶體增生被認為是有重金屬脅迫下的一種特殊的標志物。過氧化物酶體增生一般是指過氧化物酶體體積和數(shù)量的增大。2.汞對貝類毒性效應(yīng)的研究進展1.1貝類在汞脅迫下的體液免疫抗氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽(GSH)和酚氧化酶(P0)等。超氧化物歧化酶可清除02'—和'OH而生成分子氧和H202。Fridovich(1998)指出雙殼貝類的細胞質(zhì)和細胞核中存在有Cu或Zn二聚體的形式的超氧化物歧化酶,線粒體中另有一種超氧化物歧化酶以Mn四聚體存在。Jones(1981)研究得出存在于過氧化物酶體中的過氧化氛酶含有亞鐵血紅素，可將H202還原為分子氧和水。Mannervik(1985)研究得出谷胱甘肽過氧化物酶含有Se,其作用為利用谷胱甘肽作為底物解毒多種過氧化物。谷胱甘肽的功能是作為酶促反應(yīng)的底物或以非酶促反應(yīng)的方式直接結(jié)合來消除活性氧。3.重金屬污染對雙殼貝類毒性作用研究3.1貝類對重金屬污染物生物富集作用的研究研究重金屬污染對貝類的生態(tài)毒理效應(yīng)主要從細胞、器官、個體、種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)六個層次來進行生物體因受環(huán)境污染影響，在受到嚴重損害前，不同生物學(xué)水平上(分子、細胞、個體等)表現(xiàn)出來的異?；盘栔笜吮唤凶錾飿酥疚?。應(yīng)用于重金屬污染研究的生物標志物有:生物富集作用,生化反應(yīng)，細胞結(jié)構(gòu)分析，生理學(xué)特征，(zaroogian&Jaekim,2000;MatozZOetal2001;Koukouzika&Dimitriadis,2005;Rheeetal.,2007;Munari&Mistri,2007)。早期廣泛應(yīng)用的生物標志物主要是生物污染物富集量調(diào)查,隨著生物化學(xué)、細胞生物學(xué)!免疫學(xué)和分子生物技術(shù)在生態(tài)毒理研究的應(yīng)用和發(fā)展，環(huán)境污染物和生物大分子(蛋白、酶和核酸)的相互作用成為了研究的熱點。關(guān)于海域重金屬污染脅迫下，海洋生物細胞內(nèi)金屬硫蛋白誘導(dǎo)、氧化損傷、細胞毒理反應(yīng)!溶酶體改變、免疫受損和DNA加合物生成的研究工作迅速廣泛開展，有些特殊的未知蛋白被發(fā)現(xiàn)、提純并作為重金屬污染生物標志物而應(yīng)用(Barkaetal.,2001)。3.2重金屬脅迫誘導(dǎo)貝類金屬硫蛋白生成的研究。MT是一類低分子量,富含半膚氨酸，能大量結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，其主要生理功能是參與微量元素的貯存、運輸、代謝以及對重金屬進行解毒和清除氧自由基。MT由于具有對重金屬結(jié)合的特異性和高效性，在貝類重金屬污染研究中被廣泛應(yīng)用。Baudrimont"tal.(2003)在進行河蛆Cobiculaj7aminca受海區(qū)現(xiàn)場Cd和Zn暴露后的凈化研究中，發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白是一個非常重要指標。Geffard"tal.(2003)認為金屬硫蛋白相對于別的生理參數(shù)，對重金屬污染更敏感。Amiard一Triquetetal,(2998)認為，在海洋生物受到Cd污染脅迫時，金屬硫蛋白是第一步參與代謝和解毒的生物大分"Silvestreotal。(2005)認為Cd暴露水生甲殼類能誘導(dǎo)產(chǎn)生并結(jié)合金屬硫蛋白,生成無毒的CdMT復(fù)合物并貯存在組織里。Gefl妞rdetal.,(2005)認為金屬硫蛋白對重金屬的響應(yīng)具有組織特異性，雙殼貝類的消化腺作為重金屬代謝和儲存的重要組織,被用來選作金屬硫蛋白研究的目標組織。Langstonetal.(1998)認為把金屬硫蛋白的誘導(dǎo)，作為重金屬暴露后生化反應(yīng)的指標進行研究，要考慮到其它生物的或非生物的因素對金屬硫蛋白水平的影響。3.3貝類受重金屬脅迫后體液免疫反應(yīng)的研究體液免疫作為雙殼貝類一個非常重要的免疫防御手段，對于識別異己、參與異物清除和免疫調(diào)節(jié)等意義重大，主要的體液因子有:水解酶、氧化酶、凝集素、抗菌肚和神經(jīng)內(nèi)分泌激素等。酸性磷酸酶是溶酶體的標志酶，是動物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶，重金屬的脅迫能夠?qū)θ苊阁w產(chǎn)生毒害作用，使之大小、數(shù)量和膜通透性發(fā)生改變,同時增強吞噬作用和釋放大量的水解酶類。Winston&DiGiuli。(1991)認為生物體內(nèi)富集過多的重金屬會誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物(ROS，包括02一、HZO:和.OH等)，從而導(dǎo)致機體的氧化損傷(如氧化多不飽和脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化或者DNA損傷)。此時抗氧化防御系統(tǒng)會在清除活性氧自由基，抵御氧化損傷等方面發(fā)揮作用。酚氧化酶是一種具有氧化活力的銅蛋白酶，作為酶類氧化蛋白酶之一，在雙殼貝類的防御系統(tǒng)中扮演了至關(guān)重要的角色。3.4重金屬污染對貝類氧化損傷的研究雙殼貝類的氧化損傷主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化和DNA鏈斷裂。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是發(fā)生在細胞雙分子膜上的一種可以不斷加合重復(fù)的化學(xué)反應(yīng)，氧自由基將不飽和脂肪酸氧化為脂自由基，脂自由基可以和分子氧反應(yīng)生成脂質(zhì)過氧化物，并和其它的脂肪酸不斷反應(yīng)生成更多的脂自由基和脂質(zhì)過氧化物。很多學(xué)者在研究重金屬對雙殼貝類毒性損傷時，實驗中關(guān)注了貝類受損傷的組織差異性(鰓、外套膜、消化腺和斧足等)。Chingetal.(2001)認為貝類DNA損傷是一種典型的氧化損傷，一般是由過多自由基引起的,可以用來評估污染物的遺傳毒性。Pachecoetal.(2005)用微核實驗方法研究發(fā)現(xiàn)Pb脅迫后雙殼貝類的DNA單鏈斷裂程度在低濃度下比高濃度下嚴重，并認為這是機體防御反應(yīng)的開端。3.5重金屬污染對貝類細胞結(jié)構(gòu)損傷的研究污染物對細胞的損傷，可以表現(xiàn)為細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。研究污染物與細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的關(guān)系，不僅可以闡明污染物毒害作用的本質(zhì)，而且還可以評價污染物的有害性效應(yīng)，早期預(yù)警污染物對生態(tài)系統(tǒng)的影響。nDyk(2007)從組織學(xué)水平上研究了Cd和Zn對南非莫桑比克羅非魚Oreochromismossambicus的毒性效應(yīng)，研究中將受重金屬脅迫后肝臟細胞組織學(xué)變化根據(jù)形態(tài)特征分為0一4共5個等級,Cd和Zn對莫桑比克羅非魚口.mossambicus肝臟細胞組織學(xué)損傷主要包括細胞空泡化和透明化!細胞內(nèi)有嚴重的脂質(zhì)堆積、細胞腫脹卷曲和血管充血腫脹等。此外細胞結(jié)構(gòu)的損傷還可以通過電子顯微鏡從細胞超顯微結(jié)構(gòu)上來觀察。Domouhtsidou&Dimitriadis(2000)提出重金屬暴露不但影響了紫貽貝Mgalloprovincialis組織的整體形態(tài),而且導(dǎo)致消化細胞內(nèi)殘余小體的融合，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的破裂或空泡化以及嗜堿性細胞內(nèi)顆粒的增加。另外，還在鰓內(nèi)發(fā)現(xiàn)了鰓絲的融合。AbdAllah&Moustafa(2002)研究發(fā)現(xiàn)，重金屬污染可以導(dǎo)致前鰓動物Nerila:axll.li:鰓、消化腺和外套膜等組織超顯微結(jié)構(gòu)的損傷。比如在貝類消化細胞的超微切片內(nèi),發(fā)現(xiàn)有許多體積增大的高電子密度囊泡和顆粒，而這些結(jié)構(gòu)被認為是儲存已經(jīng)消除毒性的重金屬的部位。Domouhtsidou&Dimitriadis(2003)用半定量的方法評估了重金屬脅迫后光學(xué)顯微鏡下的紫貽貝對galloprovinoialis細胞組織病理學(xué)改變,用形態(tài)度量細胞學(xué)測定了電子顯微鏡下細胞形態(tài)的變化，如度量紫貽貝Mgalloprovincialis鰓高密度上皮細胞的體積大小，受脅迫后腫脹的細胞器體積變化等。3.6重金屬污染對貝類細胞溶酶體損傷的研究雙殼貝類的血細胞，特別是溶酶體，可能積累了很高濃度的重金屬(Bordinetal.,1996)。研究報道，包括有機和重金屬污染物在內(nèi)的多種肋、迫作用，都會引起貝類消化細胞溶酶體的腫脹和溶酶體膜穩(wěn)定性的下降(eajaravilleetal.,1995:Mooreetal.,2006)。溶酶體膜的變化可能會導(dǎo)致其內(nèi)部的水解酶類釋放到細胞質(zhì)內(nèi)，從而對細胞本身造成損傷(Loweetal.,1995)。溶酶體膜穩(wěn)定性衡量(LMS)在水質(zhì)監(jiān)測中被認為是在所有推薦的生物標志物中最為可信的標志物之一(UNEP,1997)，(MooreelaZ.,2007)。研究發(fā)現(xiàn),貽貝和牡礪暴露于重金屬一段時間后，其溶酶體膜穩(wěn)定性會降低，因此溶酶體膜穩(wěn)定性成為衡量細胞損傷的常用指標(Regoli,1998;Ringwoodetal.,2004)。Koukouzikaetal.,(2005)運用顯微生物化學(xué)方法鏡檢溶酶體內(nèi)水解酶的變化，來評估溶酶體的完整性和溶酶體膜的穩(wěn)定性，從而指征溶酶體的形態(tài)病理變化和生化反應(yīng)。參考文獻[1]WangQing.Studyofseveralheavymetalsandorganicpollutantsontheclamecotoxicologicaleffects[D].2010.6.[2]Lv