RNA修飾的口述歷史I表觀遺傳的黃金時代

RNA修飾的口述歷史I｜表觀遺傳的黃金時代編者按科研工作諸多時候是從無到有的，開創(chuàng)新的方向新的概念始終是科研工作者的重要目的之一，表觀遺傳作為在近年來含有活力的領(lǐng)域更是如此。近日，《自然》雜志發(fā)表了專項報道講述表觀遺傳新方向——RNA修飾領(lǐng)域的發(fā)展過程、成績及爭鳴。在此，23Plus請到了這段歷史中的重要親歷者，讓他們來講述這段驚心動魄的歷程，給我們讀者真實展示一種正在快速發(fā)展的科研領(lǐng)域。讓我們用這篇精彩文章作為整個系列的開篇，揭開這個系列的序幕。DNA與RNA上的分子標記是如何被重新發(fā)現(xiàn)？又是如何為基因體現(xiàn)調(diào)控的研究注入了新生？許多杰出的大想法似乎只是憑空而來，但是對于的何川專家來說，他正絞盡腦汁地試圖擠出一種好想法。美國國立衛(wèi)生研究院（USNationalInstitutesofHealth，縮寫為NIH）剛剛推出一系列項目，打算重金支持某些高風險、高收益的研究課題。作為伊利諾伊州芝加哥大學的一名化學家，何川專家也想申請這個項目——但是他還缺少一種好想法。在這之前，何川專家研究的是一種修復DNA損傷的蛋白質(zhì)家族；但是，他懷疑這些酶同樣也能作用于RNA?？赡苁切疫\女神的眷顧，有天，何川專家偶然遇見了在同一棟大樓里工作的潘滔專家，潘滔專家是芝加哥大學的一位分子生物學家，專門研究RNA上一種特定的化學修飾——甲基化修飾。自此之后，兩人頻繁見面，通過一次次激烈的討論，一種大膽的想法逐步成型。當時，生物學家們正在為表觀基因組（epigenome）的發(fā)現(xiàn)雀躍不已——無數(shù)種化學修飾的組合修飾著DNA和它們纏繞的蛋白骨架。這些標記就像一種個化學注釋，告訴細胞哪些基因需要體現(xiàn)，哪些基因應當沉默。通過這些標記，表觀基因組能夠協(xié)助科學家們解釋為什么盡管細胞擁有相似的DNA，卻能分化發(fā)育成不同的特化類型，形成構(gòu)造、功效各不相似的不同組織。舉個例子，就是在這些標記的協(xié)助下，心肌細胞才干維持自己的身份，不會變成神經(jīng)元細胞或是脂肪細胞。值得一提的是，癌癥細胞中的表觀遺傳標記經(jīng)常會出現(xiàn)紊亂。NikSpencer/Nature在兩人合作的早期，大多數(shù)表觀遺傳學的研究工作都還集中在DNA和包裝它們的組蛋白（histone）上。于此形成對比的是，盡管人們已在RNA上發(fā)現(xiàn)了近百種化學修飾，卻根本沒有人懂得這些修飾的作用。何川專家正在研究的一類酶能夠移除甲基基團，擦除甲基化修飾；于是兩人不禁猜想，說不定在這些酶中，會有一兩個也能在RNA上發(fā)揮相似的作用。再進一步假設，如果這種化學修飾是可逆的（即能通過生物反映加上和移除），那么它們就可能參加調(diào)控了一種操控基因體現(xiàn)的全新方式。，兩人獲得了資金支持，正式開始尋找RNA上的可逆化學標記，以及與之對應的擦除標記的蛋白質(zhì)。九年之后，這類研究獲得了一種有關(guān)自己的學名：表觀轉(zhuǎn)錄組（epitranscriptome）。何川專家和其它研究者們揭示了腺嘌呤（A，RNA的四種堿基之一）上的甲基化修飾在細胞分化的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，同時，這種修飾也很可能與癌癥、肥胖以及更多其它的疾病有關(guān)1，2。，何川實驗室與其它兩個研究組發(fā)現(xiàn)了在DNA的腺嘌呤上也存在著同樣的甲基化修飾；在這之前，甲基化修飾只在胞嘧啶（C）上被發(fā)現(xiàn)——這再次擴大了表觀基因組的豐富程度3。大量的研究工作開始跟進，“我認為我們正逐步靠近一種表觀基因組和表觀轉(zhuǎn)錄組的黃金時代?！奔~約州WeillCornell醫(yī)學院的遺傳學家ChristopherMason這樣告訴我們，“我們已經(jīng)能夠漸漸確實地‘看見’這些我們早就懂得會在那里的化學修飾了?！眒RNA——不只是信使分子生物學的黃金法則——中心法則——告訴我們，遺傳信息從DNA傳到RNA，再從RNA流向蛋白質(zhì)。由此，許多科學家都僅僅將RNA看作是DNA和蛋白質(zhì)之間的傳信員，將細胞核內(nèi)編碼的遺傳信息送往細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)工廠，這也造成了極少會有研究者會對mRNA上的化學修飾產(chǎn)生愛好。RNA上的修飾甚至一向就不是一種未被發(fā)現(xiàn)的秘密。將何川推上表觀轉(zhuǎn)錄組研究最前沿的化學修飾，其實早在1974年就在mRNA上被人發(fā)現(xiàn)4。東蘭辛市密歇根州立大學的有機化學家FritzRottman當時偶然在腺嘌呤上發(fā)現(xiàn)了一種甲基基團，于是理所固然的，他開始探究RNA在基因調(diào)控體現(xiàn)中發(fā)揮的作用。這種帶有甲基化修飾的腺嘌呤被稱作N6-甲基化腺嘌呤（N6-methyladenosine），一種更加順口的叫法是m6A。于是，Rottman和他的同事發(fā)表了有關(guān)論文，指出RNA甲基化很可能是一種轉(zhuǎn)錄本選擇性體現(xiàn)蛋白質(zhì)的調(diào)控機制?！暗沁@一切都只是我們的猜想。”KarenFriderici的語調(diào)有些無奈，她是1974年Rottman論文的作者之一，也是密歇根州立大學的一名遺傳學家。在上個世紀70年代，研究小組缺少有效的研究辦法來探究這些分子標記的真實功效，“當時分子生物學才剛剛起步，許多現(xiàn)在唾手可得的研究技術(shù)在當時根本沒有出現(xiàn)。”她解釋道。哪怕是在論文發(fā)表的30年之后，擺在何川和潘滔面前的仍舊還是同一種科學問題——缺少有效的實驗辦法?！跋胍_實地研究這些化學修飾其實是很難的。”潘滔專家這樣告訴我們。它需要高分辨、高效率的質(zhì)譜儀，以及高通量的測序技術(shù)。世上無難事，只怕有心人。在何川實驗室的兩名組員：付曄和賈桂芳的努力下，研究獲得了突破性的進展。付曄（現(xiàn)哈佛大學博士后）和賈桂芳（現(xiàn)北京大學研究員）當時正將注意力集中在一種名為FTO的蛋白質(zhì)上；FTO蛋白是何川課題組研究的去甲基酶家族中的一種部分。兩人認為FTO蛋白很可能會移除RNA上的甲基化修飾，但是要找到酶的底物并不簡樸。付曄和他的同事們開始合成帶有不同修飾的RNA片段，然后一種一種嘗試，看FTO與否能夠擦除它們。這是一項耗時巨大的緩慢過程，在整整三年的時間里，研究小組失敗了無多次?！拔?guī)缀醵伎煊X得我永遠都不可能找到FTO的功效了?！备稌峡嘈χ叵肫鹉嵌螝q月。，研究小組終于試到了他們的“真命天子”——m6A，即帶有甲基化修飾的腺嘌呤。這一次，甲基化如預期般消失了。這是RNA上的修飾第一次被證明是可逆的5，就像那些在DNA和組蛋白上被發(fā)現(xiàn)的修飾同樣。對何川專家來說，這個實驗成果看上去足以成為證明RNA系統(tǒng)參加基因體現(xiàn)調(diào)控的重要證據(jù)。證據(jù)累積何川課題組并不是唯一一種對m6A產(chǎn)生愛好的課題組。，兩組獨立的科研人員初次分別發(fā)表了m6A修飾的分布圖6，7。研究成果揭示了來自7000多個基因上的、超出1個的mRNA的甲基化位點?！霸谶@之前的許數(shù)年里，我們都只能在黑暗中探索——好在立刻就能在廣闊明亮的新視野里繼續(xù)研究了。”這句話摘自發(fā)表在Science上的一篇論文8，該文作者是DanDominissini，他也是m6A定位研究的作者之一。根據(jù)分布圖的成果顯示，m6A的分布并不是隨機的。根據(jù)m6A在基因組（轉(zhuǎn)錄組）上出現(xiàn)的位置，研究者們懷疑它很可能參加調(diào)控了RNA可變剪切（alternativesplicing）的過程。RNA的可變剪切是一種重要的調(diào)控機制，這種機制使擁有相似基因組的不同細胞能夠特異性地體現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)。在過去的幾年里，科研人員又找到了某些參加調(diào)控這些修飾標記的生化機制。每一種機制都需要三種重要的元件參加：加上修飾的修飾因子（writer），移除修飾的擦除因子（eraser），以及識別特定修飾的識別子（reader）（詳見示意圖）。當這一系列與m6A互作的蛋白質(zhì)的性質(zhì)被一一解讀之后，科學家們開始逐步意識到，m6A不僅可能影響RNA的可變剪切，還會影響蛋白質(zhì)翻譯以及RNA的穩(wěn)定程度。NikSpencer/Nature舉例來說，m6A的一種識別子就能將帶有這種標記的mRNA分子送往細胞內(nèi)的降解工廠，促使這些mRNA更快降解。而另一種識別子卻能引導帶有甲基化修飾的RNA定位至核糖體，增進該蛋白質(zhì)的合成。那么，我們不禁會問，終究是什么因素決定了m6A在細胞中起到的作用呢？m6A終究是協(xié)助蛋白質(zhì)合成，還是破壞轉(zhuǎn)錄本呢？有兩個因素決定了標記的作用：該修飾在轉(zhuǎn)錄本上的位置，以及與修飾結(jié)合的識別子蛋白的性質(zhì)。但是要是想繼續(xù)進一步研究，理清這兩者背后的生化機制的話，無數(shù)的工作與挑戰(zhàn)都會隨之而來。以色列特拉維夫大學（TelAvivUniversity）遺傳學家GideonRechavi客觀地指出了研究的巨大難度，他也參加了繪制了m6A的分布圖譜。但是現(xiàn)在，科研人員最少能夠擬定m6A修飾在細胞分化的過程中起到了至關(guān)重要的作用。缺少該修飾的細胞將會停留在類似干細胞（stem-）或祖細胞（progenitor-）的狀態(tài)。這種缺失也可能造成致死的后果：當何川及其共同工作者將小鼠中的一種m6A修飾因子失活之后，許多胚胎在尚未出生前就胎死腹中。對于m6A的作用，何川有一種自己的假設。當細胞狀態(tài)發(fā)生變化的時候（例如在分化時期），細胞內(nèi)的mRNA固然也會發(fā)生變化。這種mRNA水平上的變化（何川專家將它稱作‘轉(zhuǎn)錄組切換’transcriptomeswitch）必須是精確的，且必須發(fā)生在特定的時間段。何川專家認為，甲基化修飾很可能是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的“時鐘標記”，使數(shù)千條的mRNA能夠同時發(fā)生變化。固然也不是全部人都信這一套。一位自稱是“RNA怪才”的生物學家WendyGilbert（MIT麻省理工學院）就認為什么川的理論有些言過其實，“這樣數(shù)年以來，有一點我是很佩服他的——何川始終孜孜不倦地努力強調(diào)這些分子標記真正重要的地方?！彼@樣說道。但同時她也指出，很顯然尚有許多其它的途徑也參加調(diào)控了基因的體現(xiàn)。一種很容易想到的例子就是microRNA——一類不編碼蛋白質(zhì)，卻參加基因沉默的小片段RNA。“我不認為m6A是達成這一切的唯一途徑?！彼a充道。腺嘌呤中的奧秘科學家們很早就懂得構(gòu)成RNA的四種堿基上都存在著許多化學修飾的類型，而與此相對的，哺乳動物的DNA上似乎只有相稱有限的修飾標記，并且都發(fā)生在胞嘧啶上。哺乳動物中最常見的DNA修飾是5-甲基胞嘧啶，也被稱為5mC，這種化學修飾極其重要，人們常把它當作是A、T、C、G之外的第五種堿基。然而即便如此，何川卻仍舊懷疑在基因組中還存在著其它的修飾標記。在細菌中存在著一類與m6A對等的DNA修飾——N6-甲基腺嘌呤，或6mA?！凹毦\用甲基化來分辨內(nèi)源、外源的DNA。”馬薩諸塞州波士頓小朋友醫(yī)學院的生物化學家EricGreer這樣告訴我們。但是研究人員始終沒能在更復雜的生命系統(tǒng)中確認6mA的存在。，何川實驗室的博士后付曄找到了一篇上世紀70年代的文獻，該文獻證明在海藻的DNA上發(fā)現(xiàn)了甲基化修飾的腺嘌呤9?！皼]有人懂得這種修飾終究起了什么作用，也沒有人繼續(xù)跟進這項研究發(fā)現(xiàn)?！备稌险f道。付曄和當時實驗室的另一名博士后駱觀正決定將這項研究工作繼續(xù)下去，繪制出6mA在海藻ChlamydomonasDNA上的分布圖譜。他們在超出14，000個基因上都發(fā)現(xiàn)了6mA修飾的痕跡，并且6mA的分布并不是隨機的，它們團聚在轉(zhuǎn)錄的起始位點?！拔覀冇^察到某些峰值呈現(xiàn)出周期性的分布，一種接著一種。”付曄這樣描述。根據(jù)這些實驗數(shù)據(jù)，他們推測6mA修飾或許能夠增進基因的活化。而在距離他們公里左右的波士頓，研究員Greer和他的同事們在線蟲（Caenorhabditiselegans）的基因組里發(fā)現(xiàn)了6mA。Greer當時是施揚老師實驗室的一名博士后，正在運用線蟲的一類突變體研究表觀遺傳的代際傳遞，這類突變體的生育能力會隨著世代的傳遞逐步減少。Greer想懂得這種不育的特性是如何實現(xiàn)由親本向子代的傳遞。長久以來，人們始終都認為線蟲缺少甲基化修飾的分子標記，但是Greer想再試一試，用結(jié)合特定甲基化修飾的抗體設計實驗再次驗證。他們確實沒有找到任何5mC，但是他們卻檢測到了6mA。更加令人興奮的是，他們發(fā)現(xiàn)在生育能力更差的世代當中，6mA的水平提高了，“這闡明6mA很有可能就是一種傳遞表觀遺傳信息的載體?！盙reer說道。這個實驗成果出乎了全部人的意料，在這之前，人們并不是沒有在多細胞生物中尋找過6mA，但是由于6mA的體現(xiàn)水平實在太低了，沒有人能夠真正檢測到它的存在。聯(lián)系Greer的發(fā)現(xiàn)，施揚老師想起了何川實驗室在海藻中發(fā)現(xiàn)了6mA，他覺得這是一種合作的好機會。當何川專家據(jù)說了施揚老師的發(fā)現(xiàn)后，他也十分激動，當即就決定合作。幾個月之后，何川專家又碰到了另一名同行，他在果蠅里也發(fā)現(xiàn)了6mA修飾的存在。“我當時激動得都快暈倒了?！焙未ǜ嬖V我們。4月，這三篇論文同時發(fā)表在Cell上10-12。并不是只有何川等人才對6mA感愛好。當時正在耶魯大學研究表觀遺傳學的AndrewXiao在論文發(fā)表后看到了這三篇研究，Xiao和他的同事們已在哺乳動物細胞里發(fā)現(xiàn)了6mA的存在，但是他們還沒有發(fā)表這項研究成果，“我們原來放心地覺得沒人會對這個領(lǐng)域產(chǎn)生愛好的?！盭iao也很無奈，Cell上發(fā)表的論文告訴了他這個殘酷的現(xiàn)實，“我們意識到我們得抓緊時間了?！币荒曛?，Xiao和他的同事們證明了6mA以極低的濃度出現(xiàn)在了小鼠的胚胎干細胞之中。當研究者們細究6mA的分布時，他們發(fā)現(xiàn)6mA的最高峰值都集中在X染色體上——這似乎暗示了6mA參加介導了基因沉默。同時，研究者們也發(fā)現(xiàn)了一種疑似6mA擦除因子的蛋白質(zhì)。直到現(xiàn)在，Xiao還不能闡明6mA的作用。但是他還是告訴我們，6mA應當類似于一種分子開關(guān)，在發(fā)育過程中起到了至關(guān)重要的作用。它僅僅在很短的時間內(nèi)存在著——然后就像有一陣大浪襲來，全部的標記都會像沙灘留痕普通消逝無蹤。“Xiao的論文對我們而言簡直是一枚重磅炸彈。”威爾康奈爾醫(yī)學院的研究者SamieJaffrey這樣評論，“它明確指出了6mA是一種功效性的元件?！笔P老師和何川老師都表達他們也在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)了6mA的存在，但是具體的實驗成果尚未發(fā)表。但是研究者們也不能過分樂觀，施揚老師告訴我們，對6mA生物學意義的研究尚有很長的路要走。即使是運用現(xiàn)有的最先進的技術(shù)，也只能堪堪檢測到6mA修飾，并不能實現(xiàn)該修飾的精擬定位；并且不同組織中6mA的修飾模式也可能存在很大的差別。同時，尚有某些核心的問題也尚待解決。紐約大學藥學院遺傳學家MamtaTahiliani就認為即使有關(guān)6mA的研究工作相稱振奮人心，但不可否認的是，還沒有一項研究工作能夠令人信服地證明該標記能夠遺傳給后裔——而可遺傳正是表觀遺傳中不可或缺的特性之一。尋找新標記——工作進行中正當不少