SOD酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)

摘要：通過對(duì)綠豆種子的研磨破碎獲得SOD粗酶，經(jīng)過硫酸銨分級(jí)分離、透析除鹽和濃縮等過程，除去粗酶液中的雜質(zhì)及干擾蛋白，采用葡聚糖（SephadexG-100）凝膠層析得到純化的SOD酶。跟蹤提純過程活性的分布，并評(píng)價(jià)提取過程各步驟的效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)隨著不斷的分離提純，總活力以及總蛋白不斷減小，比活力不斷上升，最終得到的結(jié)果為總純化倍數(shù)為0.68，活性得率為5.24%。前言：超氧化物歧化酶簡(jiǎn)稱SOD，是一種新型酶制劑，屬金屬酶。分布很廣，幾乎從哺乳動(dòng)物到細(xì)菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧陰離子（O2-）歧化反應(yīng)的酶類，能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由過氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2，從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害。它的存在與生物體內(nèi)的解毒作用有關(guān)，也發(fā)現(xiàn)與機(jī)體的衰老、腫瘤及免疫性疾病等有關(guān)。自1968年發(fā)現(xiàn)SOD后，立刻引起科學(xué)界的高度重視，近40年來這方面的研究進(jìn)展非常迅速，它的應(yīng)用領(lǐng)域日益拓寬，SOD也有了產(chǎn)品.國(guó)外從牛紅細(xì)胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名為Orgotein.不少人研究Orgotein的藥理性質(zhì)，證明它無毒，無抗原性，能抗發(fā)炎、抗超氧離子、抗病毒感染。二十世紀(jì)80年代后期，我國(guó)關(guān)于SOD的研究及應(yīng)用也形成了熱點(diǎn)，如今已在化妝品添加劑、飲料及醫(yī)藥方面顯示了特殊效果。SOD作為治因而受到醫(yī)藥界的關(guān)注。目前中國(guó)國(guó)內(nèi)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。本實(shí)驗(yàn)以綠豆為原料提取SOD，通過各步的分離提純，應(yīng)測(cè)得酶總活力逐漸減小，比活逐漸升高.通過本實(shí)驗(yàn)掌握物質(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程，以及硫酸銨分離、透析除鹽、濃縮和葡聚糖凝膠層析等物質(zhì)分離技術(shù)。實(shí)驗(yàn)材料與方法：<一>材料:綠豆種子,市售新鮮綠豆種子浸泡蒸餾水24小時(shí)備用.<二>試劑:葡聚糖（sephadexG-100）,NaCl（AP）,磷酸氫二鈉（AP）,磷酸二氫鈉（AP）,三羥甲基氨基甲烷（Tris）,鹽酸（濃鹽酸），硫酸銨（AP）,PEG6000，考馬斯亮藍(lán)G250,磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA,連苯三酚(焦性沒食子酸),EDTA(鈉鹽),超氧化物歧化酶（sigma公司）。<三>儀器:離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)，柱層析裝置，玻璃層析柱，勻漿機(jī)，各型號(hào)燒杯、試管、量筒，帶毛塞試管，漏斗，移液槍，移液管，玻璃棒，電子天平等。<四>實(shí)驗(yàn)方法和步驟：稱25g綠豆,洗滌，蒸餾水浸泡過夜，加入250mlpH70.05mol/Lpb液，勻漿機(jī)勻漿，兩層紗布過濾，離心（3000rpm）得清液，取少量清液作為樣1進(jìn)行SOD活性測(cè)量，計(jì)算材料中SOD總活性單位及比活性單位（units/mgPr）。所得清液測(cè)量總體積，緩慢加入硫酸銨至35％飽和度，濃度為19.4g/100ml，4℃冰箱靜置分層。離心（3000rpm）取清液，取少量為樣②，測(cè)量SOD活性、蛋白質(zhì)含量測(cè)量，計(jì)算SOD總活性單位及活性單位。步驟3中的清液緩慢加入硫酸銨至65%飽和度（過程充分?jǐn)嚢瑁?℃至分層，離心（3000rpm）取沉淀，取樣③，計(jì)算SOD總活性單位及活性單位。準(zhǔn)備透析袋：透析袋事先預(yù)處理，Na2CO310g/L,EDTA1mmol/L煮沸30分鐘，蒸餾水洗滌，并浸泡于5℃所得清液測(cè)量其部體積，緩慢加入硫酸銨至65%飽和度（/100ml）（過程充分?jǐn)嚢瑁?℃靜置至分層澄清，離心除去清液，得沉淀。沉淀溶于水并定容到一定體積，裝入透析袋，于蒸溜水中透析過夜。透析后溶液用濾紙過濾得清液。重新裝入透析袋中用PEG6000包埋進(jìn)行濃縮。裝柱：先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要排除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15％。調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當(dāng)稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。但稀釋度太高則一次裝柱的高度不夠。將一根直徑稍小的玻璃棒插入層析柱底部，沿玻璃棒將膠漿徐徐注人柱內(nèi)，一邊灌膠，一邊提起玻棒。注意避免產(chǎn)生氣泡。柱要一次裝完。柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。柱內(nèi)膠面上部保留2～3cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來（層析柱平衡過程,1ml/min）。調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。（1ml/min）加樣：上述濃縮液過濾后得清液加樣，要盡量快速、均勻。一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1％～5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右.（這里用5%）。加樣應(yīng)加于柱中心，避免沿柱壁加入。洗脫：恒壓重力洗脫倍即完成收集。層析過程：①樣品：濃縮液離心過濾②上樣：5％上樣量2－3mol③洗脫:1mL/min,3mL/支，共收15管測(cè)（1）A280值，（2）SOD活性（粗略）15支管，每支3mL（3）搜集活性峰并測(cè)酶活性連苯三酚法測(cè)定SOD活性：操作：25℃，3ml50mmol/LpH8.30的Tric-HCL緩沖液，加入1050mmol/L連苯三酚（具體加入量應(yīng)每次測(cè)量前校正，加入的原則是使下面的A325變化控制在0.07／min左右），迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯(應(yīng)該用石英杯)中，每30s測(cè)一次Ａ325值，自氧化速率的變化（A）控制在0.07／min左右，加入酶液后再測(cè)連苯三酚自氧化速率的變化（A’），酶量的加入控制在使加樣后的A’在0.035/min左右。（以上A和A’的變化值不需特別嚴(yán)格，A只要控制在0.1以下0.04以上，A’變化在A的約一半左右即可）?？捡R斯藍(lán)G-250測(cè)蛋白的方法：操作方法：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:按下表加入試劑,混勻靜置2分鐘,以1號(hào)管為空白調(diào)零點(diǎn),測(cè)下各管的A595值,以吸光值(A595)為縱坐標(biāo),每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管號(hào)123456S1S2S3S4標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)/0100200300400500樣品體積/5010050100每管中蛋白質(zhì)含量/01020304050水/5004003002001000450400450400G-250染色液/ml3333333333室溫靜置2minA595樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定:取未知濃度的蛋白質(zhì)(通過適當(dāng)稀釋使其濃度控制在測(cè)量有有效范圍內(nèi)),加到試管內(nèi),再加入G250染色液3ml混勻,測(cè)其595nm下的吸光度,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量,計(jì)算其濃度.（表示為mgPr/g材料）。比活力、得率及純化倍數(shù)計(jì)算：SOD的比活力為=總活力（units）/總蛋白量（mg）SOD總得率為：總得率=最后樣品活率/樣1活率×100%純化倍數(shù)=比活2/比活1結(jié)果與討論：<一>硫酸銨分級(jí)分離、透析除鹽和濃縮過程SOD活性及蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果：1．蛋白質(zhì)含量測(cè)定：表1.牛血清制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（蛋白質(zhì)含量/ug）蛋白質(zhì)含量/01020304050OD值0140.圖1.牛血清制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（蛋白質(zhì)含量/ug）表2.連苯三酚自氧化速率(A325) 連苯三酚/ 樣=1\*GB3①10樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④表3.連苯三酚測(cè)樣品SOD活性(A325)連苯三酚/酶 樣=1\*GB3①10樣=2\*GB3②10樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④101532比活力的計(jì)算：加入酶量相當(dāng)?shù)拿富盍挝?unit)=｛（△A-△A’）/△A｝×2樣=1\*GB3①樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④提取液的總活力（或材料總活力）(unit)=加入酶量相當(dāng)?shù)拿富盍挝弧粒ㄌ崛∫嚎傮w積/測(cè)量時(shí)取樣液體積）樣=1\*GB3①樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④表4.考馬斯藍(lán)G-250測(cè)樣品蛋白含量(A595)樣品體積/OD平均值（nm） 樣=1\*GB3①250.927樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④500.784根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量：樣①ug樣②ug樣③ug樣④ug總蛋白量（mg）=（反應(yīng)液總體積/取樣液體積）×取樣液蛋白含量樣=1\*GB3①樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④SOD的比活力為=總活力（units）/總蛋白量（mg）樣=1\*GB3①樣=2\*GB3②樣=3\*GB3③樣=4\*GB3④<二>葡聚糖凝膠層析分離純化SOD實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4.葡聚糖G100凝膠層析洗脫曲線（以A280吸收作為蛋白質(zhì)含量的相對(duì)值）試管號(hào)（1）（2）（3）（4）（5）吸光值（nm）0.試管號(hào)（6）（7）（8）（9）吸光值（nm）試管號(hào)（10）（11）（12）（13）吸光值（nm）46圖2.葡聚糖SephadexG100凝膠層析分蛋白質(zhì)洗脫曲線經(jīng)連苯三酚粗測(cè)，3號(hào)管顏色最淺，而根據(jù)蛋白質(zhì)洗脫曲線看出3號(hào)管位于蛋白質(zhì)含量峰上，所以選取3號(hào)管作為目的試管收集SOD，測(cè)量其準(zhǔn)確SOD活力和蛋白含量，計(jì)算SOD比活力。連苯三酚自氧化速率:連苯三酚=10ul;△表6.連苯三酚測(cè)樣品5SOD活性(A325)試管號(hào)連苯三酚/ul樣品ul/3510(3)10(4)10 10 (5)1010 (6)10 (7)10 10 (8)10 10 (9)10 10 (10)10 10 (11)10 10 (12)10 10 36計(jì)算得：比活力提取液的總活力總蛋白量SOD的比活力得率的計(jì)算：得率=本次總活力/上次總活力×100%SOD總得率=最后樣品活力/樣1活力×100%360/6868×100%=5.24%純化倍數(shù)的計(jì)算:純化倍數(shù)=比活2/比活1=1\*GB3①÷=2\*GB3②÷=3\*GB3③÷=4\*GB3④÷步驟總活力（U）總蛋白（mg）比活力（U/mgpro）純化倍數(shù)樣16868670.7510.24樣2樣3