地黃寡糖對脂肪細(xì)胞增殖和胰島素抵抗的影響

地黃寡糖對脂肪細(xì)胞增殖和胰島素抵抗的影響

地黃是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)，已經(jīng)在中國治療糖尿病已有幾千年的歷史。地黃寡糖(ROS)是地黃的主要成分之一,具有改善造血、促進(jìn)免疫、抗腫瘤等作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明ROS無論以腹腔注射或灌胃均可降低四氧嘧啶(ALX)糖尿病大鼠的血糖,對去胸腺大鼠及老年大鼠受損的糖代謝有改善作用。由于成人糖尿病以2型糖尿病為主(占90%以上),胰島素抵抗為2型糖尿病病理生理學(xué)的中心環(huán)節(jié),作者采用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型,研究地黃寡糖對脂肪細(xì)胞增殖及胰島素抵抗的藥理作用。1材料和方法1.1試劑和儀器地黃寡糖(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍臨床藥理基地提供,其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余為單糖或二糖);3T3-L1前脂肪細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所;地塞米松(Des)(批號123K11611),胰島素(Ins)(批號024K0988),3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(批號034K3734),含酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基(批號123K83031),無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基(批號074K8300),上述試劑均購自Sigma公司;MTT(批號1313B11)購自aMResco公司;優(yōu)級新生小牛血清(批號20031219)購自蘭州民海生物工程有限公司;油紅O(批號830120)購自上?；瘜W(xué)試劑分裝廠(Chroma進(jìn)口分裝);馬來酸羅格列酮片購自葛蘭素史克(天津)有限公司(批號04060055);葡萄糖臨床檢測試劑盒,購自四川邁克公司(批號0305011)。1.2方法1.2.1%co飽和和濕度下培養(yǎng)參考AnilKumarK.L.分化前脂肪細(xì)胞的方法,對細(xì)胞進(jìn)行分化:將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板,待細(xì)胞融合2d后,加含0.5mmol.L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤,0.25μmol·L-1地塞米松,10μg·mL-1胰島素,10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,換以含10μg·mL-1胰島素的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48h,隨后以10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),2d換培養(yǎng)液1次,誘導(dǎo)分化8～12d的3T3-L1細(xì)胞,90%以上呈脂肪細(xì)胞表型可用于試驗(yàn)。1.2.2細(xì)胞不同固定移去誘導(dǎo)分化結(jié)束細(xì)胞的培養(yǎng)基,用PBS洗3次,用10%甲醛室溫下固定細(xì)胞1h,棄去固定液,PBS洗3次,然后將細(xì)胞晾干20min;加入油紅O溶液,室溫下染色2h,棄去染色劑,用異丙醇洗去未著色的染料,然后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核倒置顯微下觀察、照相。1.2.3不同處理對3-l1前脂肪細(xì)胞增殖的影響當(dāng)接種于96孔板的3T3-L1前脂肪細(xì)胞及脂肪細(xì)胞達(dá)到約80%融合時(shí),換以含不同濃度地黃寡糖的培養(yǎng)基孵育48h,用葡萄糖臨床檢測試劑盒測定培養(yǎng)基上清液中的葡萄糖含量,計(jì)算每組細(xì)胞的葡萄糖消耗量,然后每孔加入MTT(5mg·mL-1)10μL繼續(xù)孵育4h,將培養(yǎng)基倒盡,吸干,每孔加入二甲基亞砜200μL,混勻后置酶標(biāo)儀570nm處測定吸光度,觀察地黃寡糖對3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增殖的影響。1.2.4胰島素抗性對分化好的細(xì)胞分組進(jìn)行處理,加1μmol·L-1地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗,每2天換1次液,取上清液,以培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗量反映胰島素抵抗的程度。葡萄糖含量用葡萄糖檢測試劑盒測定。在胰島素抗性成立以后,設(shè)空白對照組、地塞米松模型組、陽性對照組(羅格列酮,終含量為3.4μg·mL-1),ROS處理組,終含量分別為0.1,0.3,1,3,10,30μg·mL-1。上述各組分別不加胰島素處理和加胰島素(10μmol·L-1)處理。分別在藥物處理24,48,72,96h后檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量。1.3統(tǒng)計(jì)處理各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間差異的顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.13細(xì)胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化前的3T3-L1脂肪細(xì)胞呈典型的梭形,胞漿中無脂滴,形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似(圖1,2)。當(dāng)細(xì)胞完全匯合后,處于生長停滯,在多個(gè)視野下均未見處于明顯分裂相的細(xì)胞,誘導(dǎo)分化第4天時(shí),細(xì)胞變大、變圓,細(xì)胞中有脂滴出現(xiàn),用油紅O染色后脂滴著紅色,細(xì)胞核著藍(lán)色。誘導(dǎo)分化第8天時(shí),有較多的細(xì)胞出現(xiàn)雙核;誘導(dǎo)分化第12天時(shí),90%的3T3-L1前脂肪細(xì)胞都分化為成熟的脂肪細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞漿豐富,含有大量的脂滴,脂滴分布于核周圍,形成“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu),為典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài),能觀察到許多富含脂滴的脂肪細(xì)胞正在分裂成為2個(gè)細(xì)胞,油紅染色后脂滴著紅色,細(xì)胞核著藍(lán)色(圖3,4)。2.2羅格列酮對3gs-l前脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用無論胰島素存在與否,地黃寡糖對3T3-L1前脂肪細(xì)胞均具有促進(jìn)增殖作用,地黃寡糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞的增殖均具有抑制作用,在0.1～30μg·mL-1呈明顯的量效關(guān)系。羅格列酮(3.4μg·mL-1)對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖呈抑制作用,與地黃寡糖(3.0μg·mL-1)作用相反;羅格列酮(3.4μg·mL-1)在不含胰島素時(shí)對3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖具有抑制作用,羅格列酮(3.4μg·mL-1)在含胰島素時(shí)對3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用(表1)。2.3對葡萄糖的作用對于3T3-L1前脂肪細(xì)胞,羅格列酮只有在胰島素存在下才顯示較好的促進(jìn)葡萄糖消耗利用功能。地黃寡糖在不含胰島素時(shí)即有較好的促進(jìn)葡萄糖利用的作用,在0.1～30μg·mL-1呈良好的量效關(guān)系;地黃寡糖在胰島素存在時(shí)亦有較好的促進(jìn)葡萄糖消耗的作用,但不如羅格列酮明顯,此結(jié)果顯示地黃寡糖的作用與羅格列酮完全不同。無論胰島素存在與否,地黃寡糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞,均有促進(jìn)葡萄糖消耗的作用,而羅格列酮僅在胰島素存在時(shí)具有促進(jìn)葡萄糖消耗的作用(表2)。2.4對各組培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖濃度的影響在地塞米松作用下,模型組對胰島素的敏感性降低,對培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取減少,說明造模成功(與空白組比較P<0.001)。加藥處理24,48,72,96h后分別測定各組培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度,羅格列酮組與地黃寡糖各劑量組均較胰島素抵抗模型組有降低,且隨著時(shí)間的變化各組培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度逐漸降低,地黃寡糖不加胰島素處理組在72h與96h時(shí)0.1～30μg·mL-1呈良好的量效關(guān)系(與地塞米松模型組比較P<0.001);地黃寡糖加胰島素處理組在96h時(shí)0.1～30μg·mL-1呈良好的量效關(guān)系(與地塞米松模型組比較P<0.001),其最佳劑量為10μg·mL-1,且地黃寡糖加胰島素組的作用與羅格列酮非常接近(表3)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析胰島素抵抗為2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié),尚未找到有效的控制措施。本實(shí)驗(yàn)采用體外胰島素抵抗細(xì)胞模型研究了地黃寡糖(ROS)對脂肪細(xì)胞增殖及胰島素抵抗的作用。中藥地黃為治療糖尿病的四大“圣藥”之一,在糖尿病治療方面具有悠久的歷史。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)從地黃中提取的地黃寡糖對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型與生理性高血糖均有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)選用了3T3-L1脂肪細(xì)胞作為體外研究載體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明地黃寡糖作用于地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞,明顯降低了細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量,其作用與胰島素增敏劑羅格列酮相似,這說明地黃寡糖具有改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),增強(qiáng)脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取和利用的能力,從體外細(xì)胞水平上說明地黃寡糖具有改善胰島素抵抗的作用。但同時(shí)地黃寡糖抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化,促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖,抑制脂肪細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)前脂肪細(xì)胞與脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取和利用,這些效應(yīng)又完全不同于羅格列酮,這提示地黃寡糖在增加細(xì)胞葡萄糖攝取的同時(shí)