【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具(含DNA粗提取)課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

1944年艾弗里等人證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移。1950年埃特曼發(fā)明了一種測定氨基酸序列的方法。1958年梅塞爾森和斯塔爾用實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。1970年科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。1972年，伯格成功構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。1973年，證明質(zhì)粒可以作為基因工程的載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，基因工程正式問世。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。1984年，我國科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚。1985年，穆里斯等人發(fā)明了PCR。1990年，人類基因組計劃啟動。2003年完成21世紀(jì)以來，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測序技術(shù)，加速了人們對基因組序列的了解。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊首次報道利用最新的基因組編輯技術(shù)編輯了哺乳動物基因組。該技術(shù)可以實現(xiàn)對特定基因的定點插入、敲除或替換?？萍继剿髦坊蚬こ痰恼Q生和發(fā)展是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)?；蛑亟M②操作水平：③操作結(jié)果：①操作原理：DNA分子水平定向的改造生物遺傳性狀，獲得人們所需的生物類型和生物產(chǎn)品基因工程人的胰島素基因能通過拼接并在受體細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)出相同蛋白質(zhì)--胰島素的理論基礎(chǔ)是？（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是

。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是

。

（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來的蛋白質(zhì)相同，因為

。（4）遺傳信息的傳遞都遵循

。

DNA中心法則基因的組成、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼基因工程第3章基因工程重組DNA技術(shù)的基本工具01基因工程的基本操作程序02基因工程的應(yīng)用03蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用04為了棉花姓“中國”1992年，一場史無前例的棉鈴蟲災(zāi)害以迅雷不及掩耳之勢吞噬著中國的棉田，我國棉花產(chǎn)業(yè)遭遇滅頂之災(zāi)；國外公司拒絕出售抗蟲棉核心技術(shù)，到1999年外國抗蟲棉已占領(lǐng)我國95%的棉花市場份額，國內(nèi)棉花品種市場迅速流失。1998年中棉所成功培育出我國第一個國審抗蟲雜交棉新品種——中棉所29，使低齡棉鈴蟲的死亡率超過90%；2002年成功培育出我國第一個雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種——中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲抗藥性;2017年10月13日,農(nóng)業(yè)部種子管理局副局長吳曉玲在回答媒體提問時表示,目前中國自主選育的轉(zhuǎn)基因棉花品種市場份額占到95%以上,國外品種不到5%。從社會中來蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因普通棉花(無抗蟲特性)棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)與運載體DNA拼接，導(dǎo)入棉花植株(有抗蟲特性)表達(dá)抗蟲基因（BT毒蛋白基因）如何獲得抗蟲棉？需要什么工具？3.1重組DNA技術(shù)的基本工具（三）分子運輸車---載體（一）分子手術(shù)刀---限制性內(nèi)切核酸酶

（二）分子縫合針---DNA連接酶“手術(shù)刀”“縫合針”“運輸車”1.來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來2.功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。3.作用部位：磷酸二酯鍵，限制酶只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵4.切割結(jié)果：切口有兩種：黏性末端和平末端限制性內(nèi)切核酸酶一磷酸二酯鍵你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?微生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解掉。生物在長期的演化過程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。限制性內(nèi)切核酸酶一思考討論1：仔細(xì)觀察以下四種限制酶識別的特定序列有何特點？限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’限制性內(nèi)切核酸酶一寫出下列限制酶切割形成的黏性末端思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端限制性內(nèi)切核酸酶一—GGG—CCCCCC—GGG—例：限制性EcoRI的識別序列和切點是－G↓AATCC－，限制性SmaI的識別序列和切點是－GGG↓CCC－。補(bǔ)充完整切割過程圖：—G—CTTAAAATCC—G——GAATCC——CCTAAG—EcoRI黏性末端掌握：末端的正確書寫—GGGCCC——CCCGGG—SmaI平末端練：限制性BamHI的識別序列和切點是－G↓GATCC－,限制性Bg1Ⅱ的識別序列和切點是－A↓GATCT－,分析兩種酶切出的末端。15怎樣的就為相同末端？1）BapⅠ識別序列－AATT－，在A與T之間切割，則其與SmaⅠ作用

后的末端能進(jìn)行連接么？

2）EcoRⅠ識別序列－GAATTC－，MunⅠ識別序列－CAATTG－并在

C與A之間進(jìn)行切割，請問這兩種酶切成的末端相同不？平末端都為相同的末端，可連接。但連接后有可能不是回文序列。黏性末端（單鏈片段）能兩兩互補(bǔ)結(jié)合，為相同的末端，可連接。反之則不是。理解

：末端是否相同G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

G

AA

TT

C

GGC

TT

AA

用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？

缺口怎么辦？DNA連接酶——“分子縫合針”2.分類：二將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。1.作用:類型來源功能相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵與DNA聚合酶的比較：DNA連接酶——“分子縫合針”二與DNA相關(guān)的五種酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈DNA連接酶——“分子縫合針”二基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”三1.作用:①

．

②

．2.作為運載體需具備的條件:

3.種類將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去利用運載體在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制①能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存

②有1個至多個限制酶切點，以便與外源基因連接③具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選④對受體細(xì)胞無害種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”三最常用的載體——質(zhì)粒:一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。DNA分子復(fù)制的起點有一個或多個限制酶酶切位點有標(biāo)記基因用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞①抗生素的抗性基因②熒光蛋白基因基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”三噬菌體或動植物病毒作為運載體的原理是：病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶限制酶DNA連接酶載體①對受體細(xì)胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒小結(jié)基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：

磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

2.實驗原理：探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度1.實驗設(shè)計思路：四DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對DNA進(jìn)行提取。3.方法步驟探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四

DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。

不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。3.選材：注意：4.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用5.方法步驟探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四析出DNADNA的鑒定研磨稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。過濾取上清液在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；取兩支試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。方法步驟（視頻）探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四注意事項1．以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。2.利用動物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法：動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可直接吸水漲破。3．加入研磨液后，必須充分研磨，否則細(xì)胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減少。4．加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5．預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點：①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四刑偵破案拓展：DNA提取的應(yīng)用基因組測序插入人胰島素基因的大腸桿菌基因工程親子鑒定探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。結(jié)果分析與評價

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現(xiàn)了失誤等。

本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四進(jìn)一步探究

實驗室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。探究·實踐·DNA的粗提取與鑒定四練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術(shù)中，將外源基因送入受體細(xì)胞的載體可以是A.大腸桿菌的質(zhì)粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用來識別特定基因的DNA探針CA練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用1.想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子?提示：迄今為止。在基因工程操作中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來的，它們可以識別DNA上特定的堿基序列并使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。微生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解。細(xì)菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因為含有某種限制酶的細(xì)胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA入侵。2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。練習(xí)與應(yīng)用（1）哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接?為什么?XbaⅠ。因為XbaI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。（2）不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義?提示：識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構(gòu)建載體時，切割位點的選擇范圍擴(kuò)大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識別序列）來獲取目的基因。練習(xí)與應(yīng)用用限制酶切割時需注意的事項(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是

。但是使用該法缺點是容易發(fā)生

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。(2)獲取一個目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個游離的磷酸基團(tuán)。(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：

①切割目的基因時：

。②切割質(zhì)粒時：

。為了產(chǎn)生相同的黏性末端，