浙江舟山地區(qū)柑橘綠霉病菌對抑霉唑和葡萄球菌的抗性

浙江舟山地區(qū)柑橘綠霉病菌對抑霉唑和葡萄球菌的抗性

2008年，浙江衢州柑橘種植總面積4.4萬公頃，總面積91萬公里。這是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)來源。綠霉病是衢州柑橘貯藏期的最主要病害,若不進(jìn)行藥劑處理,到次年3月中旬約有20%～30%的柑橘會因感染綠霉菌Penicilliumdigitatum而腐爛。因此,采收后24h內(nèi)進(jìn)行藥劑浸果處理是控制貯藏期內(nèi)柑橘爛果的重要措施。在20世紀(jì)80年代至90年代初,衢州柑橘浸果處理普遍推廣使用苯并咪唑類殺菌劑,如多菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈。后因抗藥性問題,自1990年起逐漸被咪唑類殺菌劑抑霉唑和咪鮮胺所替代。然而,最近幾年使用原有劑量的咪唑類殺菌劑其防治效果已嚴(yán)重下降,有時(shí)甚至失效。已有的研究發(fā)現(xiàn),柑橘綠霉病菌對抑霉唑的抗性存在兩種分子機(jī)制:1)抑霉唑靶標(biāo)基因甾醇-14-α-脫甲基酶P450(CYP51)啟動子區(qū)126bp增強(qiáng)子增加了4次(共5次)的串聯(lián)重復(fù),稱之為IMZ-R1型;2)在126bp增強(qiáng)子區(qū)間發(fā)生了1個(gè)199bp片段的插入突變,稱之為IMZ-R2型。其共同特征是啟動子區(qū)發(fā)生片段插入,導(dǎo)致CYP51表達(dá)的上升,從而使得菌株對抑霉唑的敏感性下降?；谶@些突變,已發(fā)展了利用常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測或聯(lián)合檢測兩種抗性類型的技術(shù)。最近,本研究組發(fā)現(xiàn)了另一種抗性分子機(jī)制,即病菌在CYP51上游并無插入突變,而是在CYP51B(與CYP51同源)基因啟動子區(qū)存在一個(gè)199bp插入突變,該片段的插入引起了CYP51B基因表達(dá)的上升和病菌對抑霉唑抗性的增強(qiáng),我們稱該抗性類型為IMZ-R3型。已知多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的靶標(biāo)位點(diǎn)為β-微管蛋白。柑橘綠霉病菌對該類殺菌劑的抗性存在兩種分子機(jī)制,即靶標(biāo)基因的198位或200位的氨基酸點(diǎn)突變。但關(guān)于我國柑橘綠霉病菌種群對該類殺菌劑屬于上述哪種抗性機(jī)制,目前尚不明確。自2000起,在浙江衢州柑橘上就陸續(xù)發(fā)現(xiàn)抗咪唑類殺菌劑的綠霉病菌菌株,但并未見有詳細(xì)的研究報(bào)道。多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑在衢州已停用近20年,在病菌種群普遍對咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性的背景下,了解衢州柑橘綠霉病菌種群對這類藥劑的抗性現(xiàn)狀及其抗性機(jī)制,將為衢州是否可重新啟用這類藥劑提供參考。同時(shí),掌握柑橘綠霉菌種群對上述兩類藥劑的抗性機(jī)制,將為建立抗性的快速分子檢測提供依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試劑、培養(yǎng)基2010年3月從衢州地區(qū)的柯城區(qū)、衢江區(qū)和開化縣的12個(gè)柑橘貯藏庫隨機(jī)采集綠霉病病果若干,通過單孢分離,共獲得70個(gè)單孢菌株,于PDA培養(yǎng)基斜面上4℃儲存?zhèn)溆谩?0%多菌靈(carbendazim)可濕性粉劑(鎮(zhèn)江農(nóng)藥廠有限公司);22.2%抑霉唑(imazalil)乳油(美國仙農(nóng)有限公司)。培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA(馬鈴薯200g,葡糖糖20g,瓊脂20g,去離子水1000mL和PDB(PDA中不加瓊脂的液體);CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)抽提液:CTAB質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,NaCl1.4mol/L,Tris·HCl100mmol/L,乙二胺四乙酸(EDTA)20mmol/L,巰基乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%;Goldview染色液(北京百泰克公司),用于核酸染色。1.1.2s100tmpcr儀和pac200電泳儀HZ-9210K搖床(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);S1000TMPCR儀(BIO-RAD公司);PAC300電泳儀(BIO-RAD公司);GBOX-EF全自動凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司)。1.2抗阻試驗(yàn)1.2.1生長速率和抗菌率測定參考Ghosoph等的最低抑制濃度(MIC)方法,將在添加0.1μg/mL抑霉唑的PDA培養(yǎng)基上不能生長的菌株(即MIC≤0.1μg/mL)定義為抑霉唑敏感菌株(IMZ-S),將在添加0.5μg/mL或以上的抑霉唑的PDA培養(yǎng)基上能夠正常生長的菌株(即MIC≥0.5μg/mL)定義為抗性菌株(IMZ-R)。根據(jù)獲得的抗性菌株數(shù)和測定的菌株總數(shù),計(jì)算抗性菌株的百分率,即抗性頻率。抗性水平以抗性菌株與敏感菌株的EC50值的比值來表示。EC50值的測定采用菌絲生長速率法:先用無菌水將22.2%的抑霉唑乳油稀釋成1000μg/mL的母液,再用無菌水稀釋成梯度濃度藥液,將其加入到50℃左右特定體積的PDA培養(yǎng)基中,配成一系列不同濃度的含藥培養(yǎng)基。其中,測定敏感菌株EC50值所用的抑霉唑的濃度梯度為0(對照)、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4和1.0μg/mL,測定抗性菌株EC50值所用的抑霉唑的濃度梯度為0(對照)、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0和8.0μg/mL。取每mL含1×105個(gè)孢子的綠霉菌孢子懸浮液100μL,均勻涂布在PDA平板上,25℃下培養(yǎng)2d,打取直徑為5mm的菌碟,接種在含上述系列濃度抑霉唑的PDA平板中央,25℃下培養(yǎng)7d,十字交叉法測量菌落直經(jīng)。每處理重復(fù)3次,計(jì)算菌絲生長抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。EC50值的計(jì)算按周明國等方法進(jìn)行。1.2.2濃度mic分別以1.0和10.0μg/mL為多菌靈抗性篩選的最低抑制濃度(MIC)。以MIC≤1.0μg/mL為多菌靈敏感(Cab-S)菌株,MIC≥10μg/mL為多菌靈抗性(Cab-R)菌株,采用1.2.1節(jié)方法確定菌株的抗性水平和抗性頻率。1.3抗劑活性研究1.3.1dna的提取將待測的柑橘綠霉病菌菌株在PDB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/min,25℃)7d后,用紗布過濾,無菌水沖洗后收集菌絲,用CTAB法提取真菌的基因組DNA,-25℃下保存?zhèn)溆谩?.3.2pcr擴(kuò)增mb基因使用本研究組之前設(shè)計(jì)的用于檢測IMZ-R1和IMZ-R2的引物CYP51A1/CYP51R2,以及為檢測最新發(fā)現(xiàn)的IMZ-R3抗性機(jī)制而設(shè)計(jì)的引物BType-F/Btype-R,運(yùn)用常規(guī)PCR技術(shù)檢測衢州柑橘綠霉病菌對抑霉唑的抗性分子機(jī)制。引物序列見表1。用引物CYP51A1/CYPS1R2對IMZ-S、IMZ-R1和IMZ-R2菌株進(jìn)行擴(kuò)增,可分別得到約500、1000和700bp的擴(kuò)增條帶。用BType-F/Btype-R對IMZ-S、IMZ-R1和IMZ-R2菌株進(jìn)行擴(kuò)增,可獲得約800bp的條帶,從IMZ-R3菌株中擴(kuò)增可獲得約1000bp的擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)體系(20μL):10×buffer2μL、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP,2.5mmol/L)2μL、氯化鎂(MgCl2,25mmol/L)1.6μL、引物(5μmol/L)各2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、模板DNA0.4μL,以雙蒸水補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min,92℃45s-56℃1min-72℃1min,35個(gè)循環(huán)后,再于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳后使用Goldview染色液染色,并在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增條帶的觀察。1.3.3b2b基因的pcr擴(kuò)增根據(jù)已報(bào)道的柑橘綠霉病菌的β-微管蛋白基因(β-tubulin,PdTUB2)序列(Genebank登錄號:D78154),合成了一對擴(kuò)增PdTUB2基因全長序列的引物Pdtub-F/Pdtub-R(表1),采用PCR擴(kuò)增多菌靈敏感菌株和抗性菌株的PdTUB2基因。PCR反應(yīng)體系同1.3.2節(jié),循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5min后,92℃45s-58℃1min-72℃1min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳后割膠回收,直接送上海英俊公司測序。測定的基因序列先用DNAman翻譯成氨基酸,再進(jìn)行比對分析,檢查抗性菌株是否發(fā)生了有意義的突變。1.4雙抗分析通過比較和統(tǒng)計(jì)供試的70個(gè)菌株對抑霉唑與多菌靈的抗性表型的異同,確定病菌群體存在同時(shí)抗抑霉唑和多菌靈的雙抗菌系的比例。2結(jié)果與分析2.1柑橘綠霉病對酶彌勒草的抗性及其分子機(jī)制2.1.1柯城區(qū)菌株的抗性分別以0.1和0.5μg/mL的抑霉唑?yàn)镸IC,測定了采自衢州柯城區(qū)、衢江區(qū)和開化縣共70個(gè)柑橘綠霉病菌菌株對抑霉唑的抗性(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):柯城區(qū)35個(gè)菌株中有27個(gè)為抗性菌株,抗藥性頻率為77.1%;衢江區(qū)24個(gè)菌株中有9個(gè)抗性菌株,抗藥性頻率為62.5%;而開化縣11個(gè)菌株中未發(fā)現(xiàn)抗性菌株。進(jìn)一步測定其EC50值發(fā)現(xiàn),衢江區(qū)對抑霉唑的平均抗性水平高于柯城區(qū),而抗性水平最高的菌株則來自柯城區(qū),其EC50值達(dá)4.24μg/mL,是最敏感菌株(來自開化)的424倍。2.1.2cyp51基因啟動子區(qū)的擴(kuò)增和時(shí)代首先利用引物CYP51A1/CYP51R2對來自衢州的42個(gè)抑霉唑抗性菌株和28個(gè)敏感菌株的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)PCR擴(kuò)增后,從已知的IMZ-R1型菌株中可獲得1000bp的條帶(圖1,條帶1～3),從已知的IMZ-R2菌株中可擴(kuò)增獲得約750bp的條帶(圖1,條帶4～6),而從來自衢州的抗性菌株和敏感菌株卻均只得到500bp的PCR條帶(圖1,條帶7～22),表明供試的42個(gè)抑霉唑抗性菌株的抗性機(jī)制并不屬于已報(bào)道的IMZ-R1和IMZ-R2,也即在CYP51基因啟動子區(qū)既不存在額外的4個(gè)增強(qiáng)子串聯(lián)重復(fù)(IMZ-R1),也不存在增強(qiáng)子中199bp片段的插入(IMZ-R2)。當(dāng)使用BType-F/Btype-R擴(kuò)增這70個(gè)菌株時(shí),其中28個(gè)敏感菌株產(chǎn)生了800bp的條帶,而42個(gè)抗性菌株均產(chǎn)生了約1000bp的條帶(圖2),表明這42個(gè)抗性菌株的抗性機(jī)制一致,屬于IMZ-R3型,即CYP51B基因啟動子區(qū)具有199bp插入突變的抗性類型(另文發(fā)表)。2.2抗劑菌的抗劑機(jī)制2.2.1cab-s和cab-r的比例在采自柯城區(qū)的35個(gè)菌株中,Cab-S和Cab-R所占比例分別為45.7%和54.3%;在衢江區(qū)的24個(gè)菌株中,Cab-S和Cab-R所占比例分別為45.8%和54.2%;在開化的11個(gè)菌株中,Cab-S和Cab-R所占比例分別為90.9%和9.1%?？梢?柯城和衢江綠霉病菌對多菌靈的抗性頻率(>50%)均遠(yuǎn)高于開化綠霉病菌種群(表3)。2.2.2抗性菌株和敏感菌株pdtub2基因編碼區(qū)序列中氨基酸突變對8個(gè)Cab-S菌株和10個(gè)Cab-R菌株的PdTUB2基因進(jìn)行測序,將所得序列(2193bp)通過DNAman比對,發(fā)現(xiàn)在抗性菌株和敏感菌株的PdTUB2基因編碼區(qū)序列中,只有一個(gè)核苷酸位點(diǎn)(992)發(fā)生了有規(guī)律性的點(diǎn)突變,即由敏感菌株的T突變?yōu)榭剐跃甑腁,導(dǎo)致PdTUB2的200位氨基酸由苯丙氨酸(F)突變?yōu)榻j(luò)氨酸(Y)(圖3),而在其他位點(diǎn)上并無有規(guī)律性的突變發(fā)生。由此推測衢州柑橘綠霉病菌對多菌靈的抗性是由PdTUB2的200位氨基酸的點(diǎn)突變所致。2.3細(xì)菌對真菌敏感的菌株數(shù)量列表比較所研究的70個(gè)菌株對抑霉唑和多菌靈的抗性表型時(shí)發(fā)現(xiàn),大部分抗性菌株同時(shí)存在抗抑霉唑和抗多菌靈的雙抗現(xiàn)象。在42個(gè)抑霉唑抗性菌株中,有32個(gè)菌株同時(shí)也是多菌靈抗性菌株,雙抗菌株的比例占總菌株數(shù)的45.7%,占抑霉唑抗性菌株的76.2%;單抗抑霉唑而對多菌靈敏感的菌株只有10個(gè),占總菌株數(shù)的14.3%,占抑霉唑抗性菌株的23.8%;在28個(gè)抑霉唑敏感菌株中有27個(gè)同時(shí)也對多菌靈敏感,只有1個(gè)菌株是抗多菌靈而對抑霉唑敏感,占總菌株數(shù)的1.4%,占多菌靈抗性菌株的2.9%。由此可見,在柑橘綠霉菌種群中同時(shí)抗抑霉唑和多菌靈的雙抗現(xiàn)象較為普遍。3采后處理藥劑選擇不當(dāng)影響其微生物的抗性本研究結(jié)果表明:在供試的70個(gè)柑橘綠霉病菌菌株中,柯城區(qū)和衢江區(qū)種群對抑霉唑的抗性頻率已高達(dá)60%以上,平均抗性倍數(shù)分別達(dá)41.4和47.0倍,兩種群對多菌靈的抗性頻率也在50%以上;而開化縣的柑橘綠霉病菌種群則均對抑霉唑敏感,未發(fā)現(xiàn)抗性菌株,對多菌靈的抗性頻率為9.1%。作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),衢州柑橘綠霉病菌對抑霉唑的抗性機(jī)制均為IMZ-R3類型,即與CYP51B基因啟動子區(qū)發(fā)生的199bp片段插入突變相關(guān);而對多菌靈的抗性均與β-微管蛋白200位的氨基酸突變相關(guān)?？鲁菂^(qū)和衢江區(qū)是浙江衢州市柑橘的主要產(chǎn)區(qū),以耐貯藏的椪柑和胡柚為主,進(jìn)入90年代中期后普遍使用咪唑類殺菌劑抑霉唑或咪鮮胺進(jìn)行后浸果處理,為保證防治效果,使用濃度不斷提高。而開化縣不是柑橘主產(chǎn)區(qū),本研究取樣的農(nóng)戶從未使用過任何化學(xué)藥劑進(jìn)行防腐處理,因此病菌對抑霉唑敏感。由此可見,柑橘綠霉病菌對抑霉唑抗藥性種群的形成與藥劑選擇壓力密切相關(guān)。盡管苯并咪唑類殺菌劑在采后柑橘的防腐處理中已停用近20年,但抗多菌靈的菌系所占的比例在柯城區(qū)和衢江區(qū)仍高達(dá)50%以上,而且?guī)缀跛锌剐跃昃鶎儆诟呖?33個(gè)抗性菌株中有31個(gè)能在含100μg/mL多菌靈的培