鎖陽(yáng)中熊果酸含量測(cè)定方法的改進(jìn)

鎖陽(yáng)中熊果酸含量測(cè)定方法的改進(jìn)

鎖陽(yáng)是鎖定科的一種獨(dú)特植物，是一種沒(méi)有扶手的完整植物。在中醫(yī)上把植物鎖陽(yáng)的去花序干燥莖用做傳統(tǒng)的中藥鎖陽(yáng),又名“不老藥”、“金不換”和“沙漠人參”等。明代《本草綱目》記述:“鎖陽(yáng)性溫,補(bǔ)腎,益精血,潤(rùn)燥養(yǎng)精治痿弱”。近年來(lái)研究證明,它還有防癌、抗癌,免疫調(diào)節(jié),延緩衰老,對(duì)防治心血管疾病有明顯的效果。熊果酸是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物,具有抗癌、肝損傷保護(hù)、抗菌消炎和抗病毒等多方面的應(yīng)用,應(yīng)用前景廣闊。目前熊果酸的提取方法主要有微波萃取法、熱回流提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等。索氏提取法利用溶劑的回流和虹吸原理,使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┨崛?縮短了提取時(shí)間,萃取效率較高。本實(shí)驗(yàn)以鎖陽(yáng)為原料,采用索氏提取法提取熊果酸,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選出提取熊果酸的最佳工藝條件,為進(jìn)下一步開(kāi)發(fā)鎖陽(yáng)的利用價(jià)值提供了參考。1材料和方法1.1材料、試劑和機(jī)器1.1.1北京恒元啟天化工技術(shù)有限公司鎖陽(yáng):甘肅省張掖平西湖地區(qū)產(chǎn);熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品:北京恒元啟天化工技術(shù)研究院;香草醛、無(wú)水乙醇、冰醋酸、高氯酸、活性炭、石油醚(30℃~60℃)等試劑:均為分析純。紗布:科護(hù)醫(yī)療器械。1.1.2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀CARY—50型分光光度計(jì):VARIAN公司;T6新世紀(jì)型分光光度計(jì);AR2140型電子分析天平:奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;LABOROTA4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:Heidolph公司;SHB—II瞻環(huán)式真空泵:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。恒溫水浴鍋HH-S:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;粉碎機(jī):瑞安市百信藥機(jī)器械廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Dragon-Med移液槍:大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)篩:新鄉(xiāng)市三圓堂機(jī)械有限公司;索氏提取裝置一套:北京科學(xué)儀器廠。1.2方法1.2.1提取乙醇溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取5g的鎖陽(yáng)粉末(粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩)用紗布包好,放入索氏提取器中,按照不同的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為75%~95%的乙醇溶液,加熱到提取溫度,回流提取3h后,過(guò)濾,濾渣再用相同的方法提取一次。合并濾液,減壓濃縮,將濃縮液倒入比色管中,用10mL石油醚浸泡24h。然后把石油醚揮干,用10mL無(wú)水乙醇溶解,再加入0.5g活性炭脫色,攪拌過(guò)濾,重復(fù)操作,直至濾液無(wú)色,把濾液轉(zhuǎn)移至比色管中,并用無(wú)水乙醇定容至10mL,即得樣品溶液。1.2.2對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.20mg,用無(wú)水乙醇溶解后配制成100mL的溶液,即得濃度為0.1020mg/mL的熊果酸對(duì)照品溶液,備用。1.2.3香草醛-冰醋酸溶液的制備用移液槍準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于25mL比色管中,加熱揮去溶劑,再加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4mL、高氯酸1mL。在60℃水浴中加熱15min,取出放在冰水中冷卻,再加入5mL冰醋酸搖勻,5min~60min內(nèi)在548nm處測(cè)定吸光度。以未加對(duì)照品的比色液做空白,在波長(zhǎng)548nm處測(cè)定吸光度值。1.2.4熊乳酸質(zhì)量配比吸取除雜后的樣品溶液0.5mL,用無(wú)水乙醇定容至25mL,搖勻后吸取1mL加入比色管,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定吸光度,計(jì)算提取液中熊果酸質(zhì)量百分比:式中:C為熊果酸濃度,(mg/mL);N為稀釋倍數(shù);V為最初定容體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,g。1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)1.2.5.熊乳酸的提取分別用濃度為75%、80%、85%、90%、95%的乙醇,在料液比1∶20、提取溫度90℃、提取時(shí)間3h,提取2次的條件下進(jìn)行提取,測(cè)定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.熊乳酸含量的測(cè)定分別按1∶15、1∶18、1∶20、1∶25、1∶30的料液比(g/mL),在乙醇濃度為90%、提取溫度為90℃、提取時(shí)間3h、提取次數(shù)為2次的條件下進(jìn)行提取,測(cè)定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.不同液比下熊乳酸提取液的制備在乙醇濃度為90%、提取溫度為90℃、料液比為1∶20(g/mL)的條件下,分別用1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h,提取2次,測(cè)定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.熊乳酸含量的測(cè)定乙醇濃度為90%、料液比為1∶20(g/mL)、提取次數(shù)為2次、每次3h的條件下,于80、85、90、95、100℃提取,測(cè)定提取液中熊果酸的含量。1.2.6熊乳酸最佳提取工藝的確定通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)上述不同提取工藝參數(shù)進(jìn)行了初步的篩選,為了分析參數(shù)影響主次因素,得到最佳提取工藝,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以影響熊果酸提取率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為4個(gè)影響因素,在其3個(gè)水平L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),優(yōu)化最佳提取工藝。L9(34)因素水平見(jiàn)表1。2結(jié)果分析2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以吸光度(A)為縱坐標(biāo),對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.581x+0.0044,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。結(jié)果表明,熊果酸在0.0204mg~0.1020mg范圍內(nèi),熊果酸含量與其吸光度值線性關(guān)系良好。2.2單因素實(shí)驗(yàn)2.2.1料液比的影響乙醇濃度度提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,隨著乙醇濃度的增加,熊果酸的含量逐漸增加,但是增加幅度比較緩慢?？赡苁请S著乙醇濃度的增加,熊果酸的溶解度逐漸增大,同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出量也增加,這些成分與熊果酸競(jìng)爭(zhēng)同乙醇-水分子的結(jié)合,因此隨著乙醇濃度的增加,熊果酸的提取率雖在逐漸增加,但增幅很小,考慮到成本的問(wèn)題,一般乙醇的濃度在80%~95%之間較好。從圖2可以看出,隨著料液比的減小熊果酸的提取率先增加后降低。原因可能是在一定范圍的料液比中,增大溶劑的用量,容易把一些不易溶出的成分提取出來(lái),同時(shí),過(guò)小的料液比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi),造成熊果酸提取率的降低,故選取1∶20(g/mL)左右料液比較為合適。2.2.3提取時(shí)間的確定從圖3可以看出,隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng),提取率基本無(wú)變化。可能是因?yàn)榛亓鞯臅r(shí)間越長(zhǎng),溶劑中熊果酸的濃度和鎖陽(yáng)粉末細(xì)胞中的熊果酸的濃度幾乎相等,達(dá)到擴(kuò)散的動(dòng)態(tài)平衡,熊果酸的提取率增加速度逐漸變慢,同時(shí)從節(jié)約能源的角度考慮,采用提取時(shí)間2h為最佳。從圖4可以看出,隨著提取溫度的提高,提取率逐漸增加。這是因?yàn)闇囟壬?分子運(yùn)動(dòng)速度加快,增加了溶劑擴(kuò)散到固體表面以及溶質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散離開(kāi)固體表面的速度,同時(shí)也增加了溶劑被固體表面吸附以及熊果酸從固體表面解析的速度,提高了熊果酸在溶劑中的溶解度。但是考慮到儀器和能源的節(jié)約利用,選擇提取溫度為90℃為最佳提取溫度。2.3熊乳酸最佳提取工藝的確定從單因素實(shí)驗(yàn)可以看出,提取時(shí)間對(duì)熊果酸提取率影響不大,因此在正交試驗(yàn)中固定提取時(shí)間為2h,考慮乙醇濃度、提取溫度、料液比對(duì)提取率的影響。由表2極差分析可知,影響熊果酸得率的主次順序?yàn)镃>A>B,即提取溫度的影響最大,乙醇的濃度次之,料液比影響最小。乙醇索氏提取鎖陽(yáng)中熊果酸的最佳提取工藝為:A3B1C2D2,即以乙醇濃度為95%,料液比1∶18,提取溫度90℃。按照最佳提取工藝進(jìn)行提取的熊果酸的提取率為38.21mg/g。3鎖陽(yáng)中熊《以干合成》中熊《物》的提取通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定了索氏提取鎖陽(yáng)中熊果酸的最佳工藝條件為:將5g鎖陽(yáng)粉末,在料液比為1∶18,95%乙醇回流提取2