玉龍美腮丹對老齡小鼠乳頭體神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

玉龍美腮丹對老齡小鼠乳頭體神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

七寶美贊丹是著名的抗老將領(lǐng)。原方為明·李時珍《本草綱目》引自明·萬密齋《積善堂方》,其功用為:“補腎元,烏須發(fā),延年益壽。治血氣不足,羸峋周痹,腎虛無子”等。本研究主要探索七寶美髯丹對于參與記憶的老年小鼠腦Papez環(huán)路中的乳頭體(Mammillarybody)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)作用,報道如下。1材料和方法1.1藥材、藥品與儀器動物昆明雌性小鼠,清潔級,15月齡(老齡),體重(36±2)g;4月齡(青齡),體重(20±2)g,均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究中心提供。藥物七寶美髯丹,藥物與用藥量比例何首烏∶牛膝∶補骨脂∶茯苓∶菟絲子∶當(dāng)歸∶枸杞=3∶1∶1∶1∶1∶1∶1,藥材由湖南省藥材公司楚仁堂藥號提供,按水提取法制備,配成100%藥物濃度,4℃冰箱保存?zhèn)溆?抗腦衰膠囊,唐山市龍山藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號981202;尼莫通,德國拜耳公司生產(chǎn),批號483759。儀器與試劑日立H-600透射電鏡;Olympus立體顯微解剖鏡;LKB8800超薄切片機;HPIAS-1000病理圖像分析儀,同濟醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司;TP-1000電子天平,湘儀儀器廠;戊巴比妥鈉、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、鋨酸、醋酸鈾、硝酸鉛均為分析純。1.2電鏡標(biāo)本制作分組與給藥共5組。其中老齡鼠隨機分為4組,按體表面積與人等效劑量給藥,分別為七寶美髯丹組0.5g/(ml·d),抗腦衰囊組0.0164g/(ml·d),尼莫通組0.00082g/(ml·d),老齡空白對照組;另設(shè)青齡空白對照組。每組12只小鼠。灌胃給藥(20ml/kg),老、青齡空白對照組予同量蒸餾水。1次/d,連續(xù)90d。電鏡標(biāo)本制作與取材腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)將小鼠深度麻醉,經(jīng)左心室—主動脈灌注磷酸緩沖液(PBS0.1mol/L,pH7.4)50ml沖洗血管,繼之以200ml磷酸緩沖液與2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合組織固定液灌注約0.5h。迅速取腦,切取整個腦組織投入2.5%戊二醛中固定約0.5h。待腦組織稍硬后,在Olympus立體顯微解剖鏡下,取體積1mm×1mm×1mm大小的大腦乳頭體組織作為電鏡標(biāo)本。先后經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定,0.1mol/LPBS漂洗,丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB8800超薄切片機切片,醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色,日立H-600透射電鏡放大2.5萬倍觀察。每標(biāo)本隨機攝片10張用于圖像分析。2各組患者治療前后土地被膠結(jié)體的電子質(zhì)網(wǎng)和造成了一般外質(zhì)網(wǎng)老齡組的異染色質(zhì)增多,常染色質(zhì)減少,神經(jīng)元細(xì)胞大多有皺縮,核膜明顯扭曲變形,線粒體平均密度減少,體積增大,變性的線粒體較多,線粒體嵴的雙層膜結(jié)構(gòu)不清、斷裂、模糊,甚至出現(xiàn)部分線粒體空泡化,高爾基復(fù)合體擴張,呈現(xiàn)代償性改變,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴張,部分出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象,脂褐素明顯增多,且電子密度高,數(shù)量多,體積較大與外形不規(guī)則,這些改變在各用藥組均有不同程度改善,而以七寶美髯丹組作用更為明顯,見附圖。3老年大鼠臟器功能的變化乳頭體是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Nervenetwork)Papez環(huán)路結(jié)構(gòu)中的重要組成部分,也是構(gòu)成記憶(Memory)的神經(jīng)組織之一。過去認(rèn)為,記憶痕跡是彌漫地儲存于整個腦內(nèi),并沒有特殊的腦組織部位與結(jié)構(gòu),直至20世紀(jì)50年代以來,才逐漸明確記憶是在不同腦結(jié)構(gòu)構(gòu)成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中形成和儲存的。Pepaz神經(jīng)環(huán)路(下丘腦乳頭體→乳頭體丘腦束→丘腦前核→扣帶回→旁海馬回→海馬→穹窿→下丘腦乳頭體),在早期僅認(rèn)為其是參與情緒與感覺活動的一個神經(jīng)結(jié)構(gòu),現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),該環(huán)路還尤其是參與陳述性記憶(Declarativememory)的重要神經(jīng)結(jié)構(gòu)?？臻g記憶(spacememory)屬于陳述性記憶,在大鼠與猴的乳頭體被損毀時,可引起某些類型的空間記憶障礙,如鼠不能記住曾經(jīng)進入過的通道,也不能完成水迷宮測試任務(wù),人類乳頭體及其鄰近結(jié)構(gòu)破壞見于伴有嚴(yán)重遺忘癥的Kosrsakoff綜合癥等。老年具有明顯陳述性記憶能力降低,而老年乳頭體等神經(jīng)組織與功能的退化,則可能是其陳述性記憶能力降低的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,老年記憶能力下降,是機體整體衰老的一部分。我國運用中藥抗老延年歷史悠久,自2000多年前《內(nèi)經(jīng)》提出腎氣盛衰決定人的“生、長、壯、老、已”理論以來,歷代至今,大多均以腎虛致衰老立論,并且傳統(tǒng)的抗老延年方,其中以補腎為主的方約達總延緩衰老方的80%,七寶美髯丹是其中的代表方之一。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn),抗衰促智中藥復(fù)方對老年大鼠前額皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)和記憶力有明顯改善作用。本研究結(jié)果顯示,老齡組小鼠乳頭體神經(jīng)元中的脂褐素(Lipofuscin)增多。許多研究提示,人和動物的腦功能隨年齡增長而減退,并與腦內(nèi)脂褐素積累有對應(yīng)平行關(guān)系。大量脂褐素沉積在細(xì)胞內(nèi),占據(jù)一定的空間,擾亂細(xì)胞內(nèi)部的幾何結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),干擾細(xì)胞的正常代謝和功能,導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的紊亂。因此認(rèn)為,脂褐素是導(dǎo)致衰老和記憶減退的因素之一,也是腦老化的可靠指標(biāo)之一。線粒體(Mitochondrion)不僅是細(xì)胞的“能量加工廠”,而且與氧自由基的產(chǎn)生,細(xì)胞死亡的調(diào)控有關(guān),衰老時線粒體DNA易受氧自由基損傷,損傷的線粒體DNA缺乏修復(fù)能力。本研究結(jié)果顯示,老年小鼠乳頭體線粒體的形態(tài)變化,表現(xiàn)為線粒體平均體積的相對增大,數(shù)量減少,嵴斷裂以及形成腫脹與空泡等。衰老時線粒體的大量變性,可能是細(xì)胞衰老死亡的分子基礎(chǔ)之一,臨床研究亦證實線粒體的喪失對認(rèn)識功能變化起作用,與衰老的記憶能力下降密切相關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)老年組細(xì)胞核膜(Nuclearmembrane)嚴(yán)重內(nèi)陷,深淺不一,多數(shù)較深,神經(jīng)元以細(xì)胞皺縮為主要改變,同時出現(xiàn)異染色質(zhì)(Heterochromatin)相對增多且邊集現(xiàn)象,一般認(rèn)為是細(xì)胞退變前兆也是神經(jīng)元老化的標(biāo)志之一,且神經(jīng)元數(shù)目減少。老年組神經(jīng)元粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Roughendoplasmicreticulum)、高爾基復(fù)合體(Golgicomplex)出現(xiàn)損傷性變化,并隨著增齡變化而損傷逐漸加重,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡、脂粒,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。本實驗觀察七寶美髯丹組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)與分布的改變與賴紅等的報告相似,老年組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布較稀疏,并有核糖體(Ribosome)脫顆粒及游離核糖體減少的現(xiàn)象,這些變化已被公認(rèn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受抑制的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。故可認(rèn)為,隨年齡的老化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)能力有一定程度的降低,并很可能是導(dǎo)致老年乳頭體功能衰退的一個重要原因。上述Pepaz環(huán)路中乳頭體神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的一系列退變,與本室前期研究老年大鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu),以及與本室對老年小鼠海馬(另文報道)等神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果顯示,老年乳頭體超微結(jié)構(gòu)的老化改變,比老年大鼠前額皮質(zhì)、老年小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的整個超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的異常變性程度要輕,其中尤其是乳頭體線粒體較豐富、結(jié)構(gòu)較為完整,以及高爾基體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較完整等,對此差異尚未見有關(guān)報道,推測或許與前額皮質(zhì)既是大腦完成認(rèn)知(Cognition)任務(wù)的重要腦區(qū)之一,尤其是工作記憶(Workingmemory)的關(guān)鍵腦皮質(zhì)區(qū),同時還是與情緒(Emotions)關(guān)系密切的腦區(qū),海馬則是構(gòu)成記憶的重要腦區(qū)等,因此其神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)與功能的老化程度,與老年嚴(yán)重記憶、情緒等的退行性變化呈平行正相關(guān)關(guān)系,而乳頭體的神經(jīng)功能至今尚未完全清楚,或許其結(jié)構(gòu)與功能的老化改變,與衰老的記憶功能降低并非呈高度正相關(guān)關(guān)系?則有待進一步研究。尼莫通(Nimotop,有效成分為尼莫地平)是雙氫吡啶類鈣拮抗劑的第二代藥物,對衰老性記憶障礙的動物可明顯改善其聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶能力,是迄今在動物實驗中改善記憶作用最強的藥物,并在臨床對老年癡呆等多種腦功能障礙性疾病有一定療效?？鼓X衰膠囊為中成藥,主要藥物為人參、制何首烏、黨參、丹參、黃芪、茯神、石菖蒲、遠(yuǎn)志、枸杞子、菊花、山藥等。主要功效為補氣活血、強腎健腦;主治神經(jīng)衰弱、記憶力減退、老年癡呆等,其藥理實驗表明有較好增強記憶力等作用。本實驗結(jié)果顯示,在改善小鼠老化乳頭體神經(jīng)元細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)方面,各藥的作用依次為七寶美髯丹>抗腦衰膠囊>尼莫通。但各藥的作用機理尚有待進一步研究。通過七寶美髯丹對老年小鼠乳頭體神經(jīng)元干預(yù)作用的研究,我們可進一步認(rèn)為: