抗壞血酸氧化酶（ascorbateoxidaseAAO）活性測(cè)定試劑盒說明書

第第頁(yè)抗壞血酸氧化酶（ascorbateoxidase，AAO）活性測(cè)定試劑盒說明書抗壞血酸氧化酶（ascorbateoxidase，AAO）活性測(cè)定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測(cè)定之前選擇23個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。測(cè)定意義：AAO是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白，屬“藍(lán)銅氧化酶”家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO與細(xì)胞壁的代謝和生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通過質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b還原，該過程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。測(cè)定原理：AAO可直接氧化AsA，通過測(cè)定AsA的氧化量，可計(jì)算得AAO活力。實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。試劑組成和配制：試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。粗酶液提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。AAO測(cè)定操作：1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265nm。2.試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30min。3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預(yù)熱的試劑二和10μL試劑三，迅速混勻后在265nm測(cè)定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1A2.AAO活性計(jì)算公式：a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下(1).按蛋白濃度計(jì)算AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmolAsA為1個(gè)酶活單位。AAO(nmol/min/mgprot)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T=92.4×△A÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmolAsA為1個(gè)酶活單位。AAO(nmol/min/g鮮重)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T=92.4×△A÷Wε：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下(1).按蛋白濃度計(jì)算AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmolAsA為1個(gè)酶活單位。AAO(nmol/min/mgprot)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T=184.8×△A÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmolAsA為1個(gè)酶活單位。AAO(nmol/min/g鮮重)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T=184.8×△A÷Wε：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系