大腸菌群測(cè)定專(zhuān)業(yè)知識(shí)

大腸菌群測(cè)定專(zhuān)業(yè)知識(shí)大腸菌群定義

大腸菌群:

一群在37℃,

經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖,

并產(chǎn)酸產(chǎn)氣,

需氧或兼性厭氧生長(zhǎng)革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。

其中包含有大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌）、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬中一部分和沙門(mén)氏菌屬第Ⅲ亞屬。P139IMViC實(shí)驗(yàn)：I：靛靛基基質(zhì)質(zhì)，，吲哚試驗(yàn)：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚；將對(duì)二甲基氨基苯甲醛加入細(xì)菌蛋白胨水培養(yǎng)液中，吲哚與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，呈紅色反應(yīng)，形成玫瑰吲哚，為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。不出現(xiàn)紅色則為陰性。M：甲基紅MR試驗(yàn)：產(chǎn)氣腸桿菌使丙酮酸脫羧后形成中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液PH〉5.4。甲基紅指示劑呈橘黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性，大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液呈酸性PH〈5.4，指示劑甲基紅呈紅色，稱甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。V：V-P試驗(yàn)：大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為區(qū)分兩菌可采用V-P試驗(yàn)及甲基紅試驗(yàn)。產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧，氧化（在堿性溶液中）生成二乙酰，后者可與含胍基的化合物反應(yīng)，生成紅色化合物，稱V-P試驗(yàn)陽(yáng)性；大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，V-P試驗(yàn)陰性。C：檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：能利用枸櫞酸鹽（即檸檬酸）作為唯一探員的細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基呈堿性是，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)（BTB）由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)，此為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性。大腸桿菌定義

大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、

IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--細(xì)菌。

大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌）,分類(lèi)于腸桿菌科,歸屬于埃希氏菌屬。

與人類(lèi)相關(guān)大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌,包含五種:腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。大腸菌群和大腸桿菌關(guān)系耐熱大腸菌群定義:能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣,并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）衛(wèi)生學(xué)意義

大腸菌群和大腸桿菌作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)意義在于,是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量關(guān)鍵指標(biāo),作為食品中糞便污染指標(biāo)。

另外,腸道致病菌如沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬等,對(duì)食品安全性威脅很大。常常檢驗(yàn)致病菌有一定困難。而食品

中大腸菌群較輕易檢出,腸道致病菌與大腸菌群起源相同,而且在通常條件下大腸菌群在外環(huán)境中生存時(shí)間也與關(guān)

鍵腸道致病菌一致．所以大腸菌群另一關(guān)鍵食品衛(wèi)生意

義是作為腸道致病菌污染食品指示菌．

大腸菌群數(shù)高低,表明了糞便污染程度,也反應(yīng)了對(duì)人體健康危害性大小。大腸桿菌生物學(xué)特征基礎(chǔ)形態(tài):此菌為兩端鈍圓短小桿菌,通常約0.5-0.8μm*1.0-3.0

μm,多單獨(dú)存在或成雙,但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%菌株有周生鞭毛,但多數(shù)只有1-4根,通常不超出10根,故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛,有有莢膜或微莢膜,不形成芽孢,對(duì)一般堿性染料著色良好,革蘭氏染色陰性。大腸桿菌生物學(xué)特征、培養(yǎng)特征:大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng),在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃,在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng),生長(zhǎng)溫度范在范一圍般1營(yíng)5養(yǎng)-瓊4瓊46脂℃上有。3種菌落形態(tài):光滑型:菌落邊緣整齊,表面有光澤、濕潤(rùn)光滑、呈灰色,在生理鹽水中易分散;粗糙型:菌落扁平、干澀、邊緣不整齊,易在生理鹽水中自凝;黏液型:常為含有莢膜菌株。

食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。大腸菌群數(shù)定義P142GB/T

4789.3-2010大腸菌群初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵24

±

2h

~48

±

2h大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法操作步驟試驗(yàn)材料檢測(cè)樣品:奶粉

設(shè)備和材料:恒溫培養(yǎng)箱、天平、搖床、無(wú)菌移液管（1ml）、無(wú)菌錐形瓶、無(wú)菌試管、小倒管、精密pH試紙

培養(yǎng)基和試劑:LST肉湯、BGLB肉湯、無(wú)菌生理鹽水、1mol/L

NaOH、1mol/L

HCl試驗(yàn)步驟:前期準(zhǔn)備每個(gè)小組準(zhǔn)備器材:移液管1mlX6、10mlX2、錐形瓶500mlX2、試管X14準(zhǔn)備試劑:配制:LST肉湯（1000ml）和BGLB肉湯生理鹽水（500ml）?相關(guān)配方相關(guān)配方生理鹽水:8.5g+1000ml蒸餾水（一錐形瓶瓶裝

225ml,剩下裝在另外一個(gè)錐形瓶中）將相關(guān)玻璃儀器進(jìn)行滅菌前包裝將配制好LST肉湯加入試管中（注意1）,然后小心將小倒管放入肉湯中（注意2）（每組10支）

將全部東西包扎好放入滅菌鍋中滅菌20min試驗(yàn)步驟:前期準(zhǔn)備試驗(yàn)步驟:檢樣稀釋

稱取25g樣品→加入225ml生理鹽水中→搖床勻質(zhì)→制成1:10樣品勻液取一支無(wú)菌試管+9ml生理鹽水→+1ml1:10樣品→制成1:100稀釋液如2方法制成1:1000稀釋液（注意3）分別標(biāo)注好標(biāo)號(hào)試驗(yàn)步驟:初發(fā)酵用1ml無(wú)菌移液管分別吸收3個(gè)稀釋度稀釋樣品至

LST肉湯發(fā)酵試管中（每一稀釋度3管）加好后塞好試管塞,放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h試驗(yàn)步驟:復(fù)發(fā)酵1.將LTS發(fā)酵管取出,觀察倒管是否有氣泡,將初發(fā)酵產(chǎn)氣管數(shù)種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)注意:在發(fā)酵試驗(yàn)工作中,常常能夠看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?有時(shí)能夠碰到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮小氣泡。試驗(yàn)表明,大腸菌群產(chǎn)氣量,多者能夠使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,少者能夠產(chǎn)生比小米粒還小氣泡。假如對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí),能夠用手輕輕打動(dòng)試管,如有氣泡沿管壁上浮,即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生,而應(yīng)作深入試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟:復(fù)發(fā)酵與結(jié)果2.

準(zhǔn)備BGLB肉湯發(fā)酵管（分裝、滅菌等）2.

用接種環(huán)接一環(huán)產(chǎn)氣LTS發(fā)酵管至BGLB發(fā)酵管中,并記號(hào)2.

放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h2.

取出觀察倒管是否產(chǎn)氣,假如兩種發(fā)酵管均產(chǎn)氣則證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性,并依據(jù)管數(shù)查MPN檢測(cè)表（P142-143）,得出MPN值大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明MPN檢索表:

MPN

為最大可能數(shù)(Most

Probable

Number)簡(jiǎn)稱。這種方法,

對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋,

加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),

從要求反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)出現(xiàn)率,

用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度,如改用不一樣稀釋度,

則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)對(duì)應(yīng)降低或增加10倍。?初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn):

1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)所用培養(yǎng)基不一樣,

但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群定義,

即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。

LST中提供了磷酸鹽緩沖體系,

氯化鈉可維持滲透壓,

月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群生長(zhǎng),

這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯許可“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow

lactose

fermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群很多革蘭氏陰性細(xì)菌。2）初發(fā)酵陽(yáng)性管,

不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌,

經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后,

有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明,

食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟符合率,

初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)