醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)講義復(fù)習(xí)重點(diǎn)

分子生物學(xué)1.ORF答:ORF是openreadingframe的縮寫，即開放閱讀框架。在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼列，叫做一個(gè)開放閱讀框架。2.結(jié)構(gòu)基因答：結(jié)構(gòu)基因（structuralgenes）可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA,并翻譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。3.斷裂基因答：基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，一個(gè)基因不僅僅包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、位于編碼區(qū)5'端與3'端的非編碼序列和內(nèi)含子。真核生物的結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因（splitgene）。4.選擇性剪接答：選擇性剪接（也叫可變剪接）是指從一個(gè)mRNA前體中通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程，而最終的蛋白產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出不同或者是相互拮抗的功能和結(jié)構(gòu)特性，或者，在相同的細(xì)胞中由于表達(dá)水平的不同而導(dǎo)致不同的表型。5.C值答：基因組的大小通常以其DNA的含量來(lái)表示，我們把一種生物體單倍體基因組DNA的總量成為C值（Cvalue）。6.生物大分子答：生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。7.酚抽提法答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過(guò)改良，以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。8.凝膠過(guò)濾層析答：凝膠過(guò)濾層析也稱分子排阻層析或分子篩層析，利用凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。9.多重PCR答：多重PCR技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等技術(shù)加以鑒別。10.熒光域值答：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光閾值的設(shè)置是基線熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。11.退火答：溫度突然降至37-58℃時(shí)，變性的DNA單鏈在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上重新形成氫鍵開始復(fù)性。12.基因診斷答：基因診斷是通過(guò)檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)異?；蚱浔磉_(dá)異常，對(duì)人體的健康狀態(tài)和疾病做出診斷的方法。13.實(shí)時(shí)熒光定量PCR答：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。二、問(wèn)答題1.什么是SNP？試述研究SNP的意義。答：真核生物基因組中存在大量的DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性是指DNA序列發(fā)生變異從而導(dǎo)致的個(gè)體間核苷酸序列的差異，主要包括單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（tandemrepeatspolymorphism）兩類。研究SNP的意義：SNP是由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1kp就存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，共有約300萬(wàn)個(gè)之多，遠(yuǎn)多于其它類型的DNA多態(tài)性，是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。SNP被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。2.簡(jiǎn)要介紹質(zhì)粒并舉例說(shuō)明其在分子生物學(xué)中的用途。答：質(zhì)粒（plasmid）是一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。質(zhì)粒與致病菌的毒力及耐藥性有關(guān)，又是基因工程的常用載體，因而具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。其在分子生物學(xué)中的用途有：1.質(zhì)粒DNA編碼多種蛋白質(zhì)，有的與質(zhì)粒自身的復(fù)制和穩(wěn)定性有關(guān)，有的控制宿主細(xì)胞的各種性狀，如各種抗性、代謝能力、致病性、接合轉(zhuǎn)移等。根據(jù)宿主的表型可識(shí)別質(zhì)粒的存在，這一性質(zhì)廣泛應(yīng)用于重組菌的篩選和鑒定。2.質(zhì)粒的不相容性常用于質(zhì)粒的分類。基因工程中以質(zhì)粒為載體進(jìn)行基因克隆也是利用了質(zhì)粒的不相容性原理。3.請(qǐng)介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的基本技術(shù)流程并簡(jiǎn)述其原理。答：蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)工作流程——基于凝膠的工作流程（Gel-basedworkflow）和基于液相色譜的工作流程（LC-basedworkflow）。在這兩種流程中，基于凝膠的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程，通過(guò)樣品制備、樣品標(biāo)記、雙向電泳分離、圖像獲取、圖像分析，到摳點(diǎn)、酶切、點(diǎn)靶和MALDI—TOF蛋白鑒定等一整套技術(shù)手段下來(lái)，如果還加上操作自動(dòng)化，研究人員可以很方便的獲得蛋白質(zhì)性質(zhì)數(shù)據(jù)。而基于液相色譜的工作流程則可以對(duì)在雙向電泳中難以分離鑒定的高相對(duì)分子量、低相對(duì)分子量、極酸性、極堿性和疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的分離鑒定。這兩種方法結(jié)合起來(lái)可以對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行預(yù)分離、對(duì)低豐度蛋白進(jìn)行富集，還可以完成蛋白酶解后多維液相分離（MDLC）。4.簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的原理及其用途。答：酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，DNA-AD）。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄?；诮湍鸽p雜交技術(shù)平臺(tái)的特點(diǎn)，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng)中：1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能。2.利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用。3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響。4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）。第4章/第8章1. 分子克隆技術(shù)包括哪些基本步驟？答：分子克隆技術(shù)的基本步驟大致包括：①目的基因的獲??；②載體的選擇；③目的基因與載體連接；④重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；⑤重組體的篩選等；即分、切、接、轉(zhuǎn)、篩等過(guò)程。2. 目的基因和載體連接主要有哪些方法？答：目的基因與載體構(gòu)建成重組體的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的連接2).平末端連接法3).通過(guò)同聚尾連接。3. 簡(jiǎn)述分子克隆中常用的工具酶及其作用。答：在分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸內(nèi)切酶，它是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3種酶活性：1)5'→3'聚合酶活性；2)3'→5'核酸外切酶活性；3)5'→3'核酸外切酶活性；3.反轉(zhuǎn)錄酶，其功能主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用2)核酸酶H的水解作用3)依賴DNA的DNA聚合酶作用；4.DNA連接酶，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5'磷酸基團(tuán)與3’羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的兩條雙鏈DNA片段連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組；5.堿性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基團(tuán)；6.末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶，其功能主要有：1)在載體或目的基因3'末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA3'末端的同位素探針標(biāo)記；7.核酸酶S1，其作用是除去雙鏈DNA的粘性末端以產(chǎn)生平末端、除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況等。4. 舉例說(shuō)明載體應(yīng)具備的基本要素。答：載體應(yīng)具備以下特征：1)能自我復(fù)制并具有較高的拷貝數(shù)，并有適宜的分子量，一般應(yīng)<10kb；2)帶有遺傳篩選標(biāo)記；3)有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。5. 簡(jiǎn)述雙抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選的原理。答：1.雙抗生素篩選的原理是：因大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)記的特征（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無(wú)抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。2.藍(lán)白斑篩選的原理：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼β-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)α-互補(bǔ)，形成完整的β-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。6. 有哪些常用的探針標(biāo)記物？答：常用的探針標(biāo)記物有：1.放射性同位素標(biāo)記，常用標(biāo)記探針的同位素有32P、3H、35S、131I、125I等。2.非放射性標(biāo)記，常用的非放射標(biāo)記物有辣根過(guò)氧化物酶（HRP)、熒光素、生物素、光敏生物素、地高辛(DIG)等。7. 如何進(jìn)行探針的標(biāo)記？答：1.放射性同位素標(biāo)記探針的的方法有缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法等。2.非放射性標(biāo)記核酸探針的方法分為化學(xué)修飾標(biāo)記法和酶促反應(yīng)標(biāo)記法兩大類：①化學(xué)修飾標(biāo)記法是利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針?lè)肿由系哪承┗鶊F(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接或間接結(jié)合到探針?lè)肿由??；瘜W(xué)標(biāo)記法具有方法簡(jiǎn)單、成本低、標(biāo)記方法較通用，也是目前較為常用的標(biāo)記方法；②酶促反應(yīng)標(biāo)記法是將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在單核苷酸分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻人到核酸探針?lè)肿又?。這種標(biāo)記法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但其標(biāo)記過(guò)程較復(fù)雜、成本較高。8. 影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化？答：影響核酸分子雜交的因素有:雜交方法的選擇、探針的選擇、探針的濃度、溫度、雜交液的成分、反應(yīng)時(shí)間等。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化有：1.探針的選擇：針對(duì)不同的雜交實(shí)驗(yàn)，選擇不同的核酸探針，在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA探針。2.探針的標(biāo)記方法，選擇什么標(biāo)記方法視靈敏度和顯示方法等實(shí)驗(yàn)要求和條件而定。3.探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。4.雜交最適溫度，在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。5.雜交反應(yīng)時(shí)間，一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。6.洗膜溫度，雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于Tm值5~12℃進(jìn)行。7.雜交液的優(yōu)化,通常用于DNA雜交的標(biāo)準(zhǔn)雜交液為5×SSC,1.0%casein,0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%十二烷基硫酸鈉。但除了以上成分外，必要的時(shí)候可以加一些雜交促進(jìn)劑。常用的有硫酸葡聚糖，它能促進(jìn)DNA鏈之間的締合。聚合酶鏈反應(yīng)1、根據(jù)作用原理生物分子的分離純化有那幾類？答：根據(jù)作用原理生物分子的分離純化可分為：（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過(guò)濾層析等；（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。2、什么原因易引起DNA降解，該如何解決？答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鮮或反復(fù)凍融2）未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3）提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷4）外源核酸酶污染5）反復(fù)凍融。相應(yīng)的解決方法有：1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融；液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液2）在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量3）細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔4）所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌5）將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。3、簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理答：PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在反應(yīng)中混合下列物質(zhì)：模板DNA、四種dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、緩沖液及Mg2+（MgCl2），然后經(jīng)下列過(guò)程大量擴(kuò)增靶DNA?；镜姆磻?yīng)分變性、退火、延伸等三步完成。4、簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)中常見的問(wèn)題及其對(duì)策。答：1）假陽(yáng)性，預(yù)防假陽(yáng)性可采取以下措施：（1）PCR前后工序分室操作，試劑器材分室存放。（2）凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。（3）Tip頭、Eppendorf管等最好一次性使用。（4）操作人員必須戴手套進(jìn)行操作。（5）試劑小量分裝保存，用前先離心，防止開蓋時(shí)液體濺出。2）非特異性PCR產(chǎn)物，造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施有：（1）引物特異性不高，引物用量過(guò)多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引物用量。（2）TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使用質(zhì)量較好的酶。（3）Mg2+濃度過(guò)高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2+濃度。（4）退火溫度過(guò)低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)，可提高退火溫度，減少退火及延伸時(shí)間，或者采用二溫循環(huán)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。（5）熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多，適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。3）假陰性，可考慮以下原因并進(jìn)行改進(jìn)：（1）引物設(shè)計(jì)是否合理，有無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，尤其是引物3’端應(yīng)無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（2）標(biāo)本中是否有Taq酶抑制劑，Taq酶是否失活。（3）反應(yīng)體系中有無(wú)蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95℃以上加熱10分鐘使其滅活。（4）反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制PCR系統(tǒng)，用蛋白酶K重新處理?？色@預(yù)期結(jié)果。（5）循環(huán)溫度，特別是解鏈溫度是否準(zhǔn)確，退火溫度是否過(guò)高。有些PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度不符，過(guò)高則酶在前幾個(gè)循環(huán)中迅速失活，過(guò)低則模板變性不徹底。（6）檢測(cè)PCR產(chǎn)物的方法靈敏度不夠，如瓊脂糖凝膠電泳法敏感性較低。（7）靶序列發(fā)生突變、缺失等。4）引物二聚體，形成原因有：（1）兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3’端有互補(bǔ)區(qū)。（2）引物模板比例太高，可增加模板用量。（3）退火溫度過(guò)低。（4）熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多。5、簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理？答：在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線?；蛟\斷1.基因診斷常用到的方法有哪些？答：基因診斷常用到的方法有：1）PCR、2）核酸雜交、3）基因芯片、4）bDNA、5）NASBA、6）測(cè)序。2.TaqMan技術(shù)如何設(shè)計(jì)引物和探針？答：1）.TaqMan技術(shù)引物的設(shè)計(jì)原則：序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)（引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。）；Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃；引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp；引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過(guò)2個(gè)的G和C。2）.TaqMan技術(shù)探針的設(shè)計(jì)原則：先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針；探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性；探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)；盡量避開二級(jí)結(jié)構(gòu)；Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），以確保在退火過(guò)程中探針先于引物與目的片段結(jié)合，GC含量在40%－70%；探針的5’端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤——因?yàn)?'G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用；整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針；為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。3.如何對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血和地中海貧血進(jìn)行基因診斷？答：1）、鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷原理在于它的血紅蛋白中的β珠蛋白基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致β鏈第6位谷氨酸（密碼子GAG）變?yōu)槔i氨酸（密碼子GTG）。因此，對(duì)鐮刀形細(xì)胞貧血的基因診斷方法可有：1>.利用PCR-RFLP的技術(shù)進(jìn)行診斷：基于A→T的變換，改變了限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，因此在酶解正常人DNA和患者DNA后再用標(biāo)記的β珠蛋白基因?yàn)樘结樧鱏outhern雜交時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)不同的DNA條帶。限制性內(nèi)切酶MstⅡ切割的序列是CCTGAGG（其中N是任何一種核苷酸），切割正常DNA產(chǎn)生1.15+0.20kbβ珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA時(shí)，由于A→T破壞了MstⅡ的位點(diǎn)(CCTGTGG)，便形成1.35kbβ珠蛋白的DNA片段；2>.使用PCR-ASO進(jìn)行診斷：PCR-ASO使用只有幾十個(gè)核苷酸的探針，檢測(cè)被檢DNA中的同源序列。由于探針比較短，當(dāng)被檢DNA序列與探針不完全互補(bǔ)，甚至只要有一個(gè)堿基的差異，雜交分子就不能穩(wěn)定形成。已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行SouthernBlot雜交/斑點(diǎn)雜交。2）、對(duì)地中海貧血進(jìn)行基因診斷：1>.α地中海貧血的基因診斷：α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)αGene時(shí)可得到10kb片段。2>.β654地中海貧血的基因診斷：β654地中海貧血是指發(fā)生在β珠蛋白基因第二外顯子第654位C→T突變（IVS-Ⅱ-654，C→T）而引起的一種地中海貧血，該突變?cè)贗VS-Ⅱ第654位（nt654）上出現(xiàn)的單堿基取代產(chǎn)生了一個(gè)新的GT二核苷酸，聯(lián)同旁側(cè)序列構(gòu)成一個(gè)新的5′端異常的剪接位點(diǎn)，同時(shí)還激活了IVS-Ⅱ第579位（nt579）處3′端隱匿的剪接位點(diǎn)，從而將IVS-2nt589-nt652之間一段73bp內(nèi)含子序列作為額外的外顯子插入到外顯子2和外顯子3之間，產(chǎn)生了異常的β-珠蛋白mRNA。在異常剪接的mRNA中存在一個(gè)提前的終止密碼子，使翻譯提前中止而產(chǎn)生截短的不穩(wěn)定的異常珠蛋白，導(dǎo)致正常β珠蛋白鏈合成減少。根據(jù)這一原理我們可以利用RT-PCR方法診斷這種類型的地中海貧血。緒論基因（gene）：是合成有功能的蛋白質(zhì)或RNA所必需的全部DNA，包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列及為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。斷裂基因（splitegene）真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因基因組（genome）：是指一個(gè)物種的單倍體的染色體所攜帶的全部遺傳信息。C值（Cvalue）：一種生物體單倍體基因組的DNA含量總是恒定的，它通常稱為該物種DNA的C值。C值矛盾：生物體的進(jìn)化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象（又稱：C值悖論，Cvalueparadox）必需基因：指關(guān)系到生物體存活的基因，可通過(guò)基因突變的方法確定致死位點(diǎn)的數(shù)量，以得知基因組必需基因的數(shù)量重疊基因（overlappinggene）是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。類核（nucleoid）：是指原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體的形式，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)致密的區(qū)域。轉(zhuǎn)座子：能在基因組中從一個(gè)位點(diǎn)移至另一位點(diǎn)的DNA序列稱為轉(zhuǎn)座因子（transposableelement），又稱為可轉(zhuǎn)座元件插入序列(insertionsequence，IS)：2000bp以內(nèi)，兩端正向重復(fù)序列（directrepeats，DR）、反向重復(fù)序列（invertedrepeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)：2000～20000bp之間，兩端由一對(duì)IS元件組成，帶有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因和其他基因。質(zhì)粒（plasmid）：是指一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。質(zhì)粒的不相容性：兩種不同的質(zhì)粒因利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過(guò)程中會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。Alu家族是靈長(zhǎng)類基因組特有的含量豐富的中度重復(fù)序列，是散在重復(fù)序列中最大的一個(gè)家族，因序列內(nèi)部有限制性內(nèi)切酶AluI的酶切位點(diǎn)而得名。反向重復(fù)序列：是指兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上的反向排列。衛(wèi)星DNA是另一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)序列的重復(fù)單位一般由2-10bp組成，成串排列。多基因家族（multigenefamily）：是指由某一祖先基因經(jīng)過(guò)復(fù)制和變異所產(chǎn)生的一組基因。假基因(pseudogene)具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后生成無(wú)功能的蛋白質(zhì)的基因，常用ψ表示。母系遺傳。子代線粒體基因組來(lái)自母親，父系的線粒體基因組在精卵結(jié)合時(shí)一般不能進(jìn)入卵細(xì)胞。因此，在子代個(gè)體發(fā)育過(guò)程中沒(méi)有父母雙方線粒體DNA的重組發(fā)生?；蚪M學(xué)（Genomics）是一門對(duì)生命有機(jī)體全基因組進(jìn)行序列分析和功能研究的新興學(xué)科。人類基因組計(jì)劃（TheHumanGenomeProject，HGP）是二十世紀(jì)九十年代初開始啟動(dòng)的多國(guó)科學(xué)合作計(jì)劃，對(duì)少數(shù)人進(jìn)行全基因組（即24條非同源染色體，共30億堿基）的測(cè)序和拼接，繪制出人類基因的譜圖。遺傳圖譜（geneticmap）：又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。遺傳多態(tài)性：在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%物理圖譜（physicalmap）：利用限制性內(nèi)切酶將大分子DNA切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離〔堿基對(duì)(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)〕為路標(biāo)的圖譜。物理圖譜的完成是一個(gè)里程碑式的成功，它準(zhǔn)確地得出了基因的相對(duì)位置。基因圖譜（轉(zhuǎn)錄圖譜）：在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜?；蚨ㄎ豢寺。菏侵咐梦⑿l(wèi)星和SNP全基因組掃描來(lái)搜索與疾病性狀緊密相關(guān)的位點(diǎn)，從而確定疾病相關(guān)基因的位置并進(jìn)一步獲得克隆。比較基因組學(xué)：是一門新興的交叉學(xué)科，在基因組學(xué)水平上研究不同物種在基因組結(jié)構(gòu)與功能方面親緣關(guān)系、內(nèi)在的聯(lián)系，以及進(jìn)化地位。宏基因組是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)就是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象,以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段,通過(guò)非培方法進(jìn)行某個(gè)特殊生態(tài)環(huán)境中微生物群落的鑒定。主要技術(shù)包括DNA的提取、文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)基因克隆的篩選?？捎糜诎l(fā)現(xiàn)新基因、開發(fā)新的生物活性物質(zhì)、研究群落中微生物多樣性等。蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics):指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilizedpHgradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。等電聚焦（IEF）：在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象稱為等電點(diǎn)聚焦。SDS：在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過(guò)測(cè)定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過(guò)程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過(guò)一定方法將不同m/z的離子分開，并測(cè)定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖：有機(jī)分子受到電子轟擊后，會(huì)斷裂形成不同的多種離子，以離子的質(zhì)荷比m/z為橫座標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到的質(zhì)譜圖稱為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，也叫棒圖。電噴霧質(zhì)譜（ESI）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI）完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個(gè)保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個(gè)部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。肽質(zhì)量指紋圖譜法基本過(guò)程為：蛋白質(zhì)混合物樣品經(jīng)過(guò)2-DE分離后，從膠上切下需要鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，用胰蛋白酶進(jìn)行水解，胰蛋白酶在特定位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)，形成長(zhǎng)短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對(duì)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)量分析，得到肽片段質(zhì)譜圖，一個(gè)質(zhì)譜峰代表一種肽片段離子。由于各種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，胰酶水解后產(chǎn)生的肽片段數(shù)目及質(zhì)量均不相同，具有特征性，因此將得到的肽片段質(zhì)譜圖稱為PMF。肽序列標(biāo)簽鑒定法蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，在蛋白質(zhì)上隨意選取一個(gè)四肽序列，根據(jù)概率論計(jì)算，另一個(gè)蛋白質(zhì)上出現(xiàn)相同四肽序列的概率為1/204，即1/160,000，因此從理論上說(shuō)，只要測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)中5~6個(gè)氨基酸殘基的序列，就足以作為鑒別蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)簽，稱為肽序列標(biāo)簽。酵母雙雜交技術(shù)(yeasttwo-hybridsystem)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展出來(lái)的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域融合，通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。等電點(diǎn)：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳:利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等點(diǎn)聚焦：就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上；基因工程基因工程（geneengineering）：又稱DNA重組技術(shù)（DNArecombination），是指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。分子克?。╩olecularcloning）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）：簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文結(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識(shí)別）。粘性末端（stickyend）：指限制酶錯(cuò)位切開兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。同工異源酶（isoschizomers）：指來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。同尾酶（isocaudarner）：指識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的酶。Klenow片段：補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端，同時(shí)可使3末端DNA標(biāo)記上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。TaqDNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依賴于聚合作用的5→3外切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：在載體或目的基因3末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA3末端的同位素探針標(biāo)記。DNA連接酶（DNAligase）：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來(lái)。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團(tuán)。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，從RNA或DNA上除去5端的磷酸。T4多核苷酸激酶核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產(chǎn)生平末端。除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況。載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA?？寺≥d體：能將載體外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長(zhǎng)為4.36Kb。pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細(xì)菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，可將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。M13噬菌體粘粒(cosmid)是由質(zhì)粒和噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。表達(dá)載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。報(bào)告基因：是指處于待測(cè)基因下游并通過(guò)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來(lái)反映上游待測(cè)基因功能的基因，又稱報(bào)道基因。終止子：一個(gè)基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。增強(qiáng)子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件?；蚪M文庫(kù)（genomiclibrary，G-文庫(kù)）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。轉(zhuǎn)化（transformation）：是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。藍(lán)白斑篩選法：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)-互補(bǔ)，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍(lán)白斑篩選法。變性（denaturation）：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程。融解溫度（meltingtemperature，Tm）：在熱變性過(guò)程中，紫外吸收增加達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。復(fù)性（renaturation）：指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為“退火”。核酸分子雜交（molecularhybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程稱為分子雜交或核酸分子雜交。核酸探針（nucleicacidprobe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交，雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子。原位雜交（Insituhybridization）是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。熒光原位雜交（fluorescencein-situhybridization,FISH）是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)?；蛐酒?genechip)：又稱DNA芯片（DNAchip）或DNA微陣列（DNAmicroarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。該技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)是生命科學(xué)界的重大發(fā)明，是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶可識(shí)別特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡(jiǎn)稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。多重PCR(multiplexPCR)PCR一般由一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，以此手段診斷疾病的效率低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50～100:1。在PCR最初10-15個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個(gè)循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時(shí)單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列的要求。反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長(zhǎng)片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法重組PCR（recombinantPCR）：將兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術(shù)主要應(yīng)用于DNA片段的任何位置引入點(diǎn)突變、插入、缺失以及兩個(gè)不相鄰片段的連接。其基本原理是將突變堿基、插入或缺失片段、或一種物質(zhì)的幾個(gè)基因片段的部分堿基設(shè)計(jì)在引物中，先分段對(duì)模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的產(chǎn)物是一重組合的DNA。擴(kuò)增曲線熒光閾值：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值Ct值：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)SYBRGreen：只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光（SYBRGreen1結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析TaqMan：5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針MolecularBeacon：分子信標(biāo)生物分子的分離純化生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。生物大分子：勻漿(Homogenization)細(xì)胞被置于一密閉的容器中(常為玻璃).勻漿器配有一非常合適的插頭,通過(guò)其上下及左右的往復(fù)運(yùn)動(dòng)來(lái)破碎細(xì)胞.超聲(Sonication)超聲波發(fā)生器可直接浸入到細(xì)胞懸浮物中,超聲波發(fā)生器會(huì)經(jīng)振動(dòng)發(fā)出高頻率的聲波而使細(xì)胞破碎.PMSF(苯甲基磺酰氟)β－巰基乙醇（β-mercaptoethanol）二硫蘇糖醇(DTT)還原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly）鹽溶--在低濃度時(shí),由于鹽能屏蔽蛋白之間的電荷-電荷相互作用,添加鹽通常會(huì)增加荷電分子的溶解性。鹽析--大量鹽奪走水分子，破壞水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞親水膠體，蛋白質(zhì)分子形成沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法降低水溶液的介電常數(shù)，減少溶劑的極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。選擇性沉淀法生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀而得到分離提純。常用的有熱變性，選擇性酸堿變性，有機(jī)溶劑變性等電點(diǎn)沉淀法不同等電點(diǎn)的電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，主要用于去除雜蛋白有機(jī)聚合物沉淀法聚乙二醇PolyethyleneGlycol,PEG透析：將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品置于袋內(nèi)，將透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到部分純化。密度梯度離心法：雙鏈DNA,單鏈DNA,RNA和蛋白質(zhì)具有不同的密度，可用密度梯度離心形成不同密度的純樣品區(qū)帶，達(dá)到分離目的。酚抽提法(SDS法）本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過(guò)改良，以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。甲酰胺解聚法1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺（formamide）解聚法，該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過(guò)火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶K和有機(jī)溶劑。玻棒纏繞法用該法收集高分子量DNA的沉淀始于20世紀(jì)30年代，現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進(jìn)而來(lái)。本法有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細(xì)胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無(wú)水乙醇中轉(zhuǎn)移至pH8.0的TE緩沖液中。堿裂解法染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開。SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時(shí)可破壞DNA鏈的堿基配對(duì)，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。CsCl-EB法：利用CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過(guò)量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。聚乙二醇沉淀法（一種分級(jí)沉淀法）柱層析法（樹脂）酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：分離總RNA磁性球珠分離法該法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補(bǔ)配對(duì)、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對(duì)poly（A）+RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。純度（purity）或比活性（specificactivity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中靶蛋白的含量或生物學(xué)活性（比活常以活力單位數(shù)/毫克蛋白質(zhì)表示），即從蛋白混合物中設(shè)法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最高值。鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。等電點(diǎn)沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。凝膠過(guò)濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長(zhǎng)、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過(guò)篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。離子交換層析：根據(jù)各種離子或離子與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分類純化密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法電泳(elctrophoresis)：蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳。(elctrophoresis)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場(chǎng)作用下自然形成。按照等電點(diǎn)的大小，生物分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦。親和層析（AffinityChromatography)是以蛋白質(zhì)與結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力為工作基礎(chǔ)。配基可以是生物學(xué)特異的，如底物、抗體、抑制劑、輔酶及蛋白質(zhì)（如抗原、抗體）、核酸。也可以是具有相對(duì)特異相互作用的凝集素（糖結(jié)合蛋白）、染料和疏水分子(亦可歸屬疏水相互作用色譜)。親和層析是應(yīng)用了特定蛋白的生物學(xué)特異性而不是物化特性。具有親和選擇性強(qiáng)，純化效率高，可以一步純化。GST融合載體毛細(xì)管電泳（CE）高效液相色譜（HPLC）分子生物學(xué)新技術(shù)及其應(yīng)用代謝組(metabolome)是指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合,包含一系列不同化學(xué)型的分子,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質(zhì)的催化產(chǎn)物等。代謝組學(xué)：通過(guò)考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來(lái)研究生物體系的一門科學(xué)。高效液相色譜技術(shù)（HPLC）高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS)：毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的的新型液相分離技術(shù)，通過(guò)離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。只有CE，解釋不完整。核磁共振技術(shù)（NMR）：基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場(chǎng)的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級(jí)躍遷譜學(xué)，主要用于反映化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。miRNA：是由21~25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA；它通過(guò)與靶基因的3-UTR的配對(duì)，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA基因克隆：miRNA克隆是依賴于其本身的特殊結(jié)構(gòu)，5′端的磷酸基團(tuán)和3′端的羥基基團(tuán)，以T4RNA連接酶在分子末端加上連接子，然后利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得目的片段，克隆到合適的載體，最后測(cè)序驗(yàn)證。PAGE/Northernblotting：基本原理：PAGE/Northernblotting與常規(guī)核酸雜交技術(shù)原理相同，都是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，設(shè)計(jì)特異探針，與膜雜交，經(jīng)放射自顯影后分析雜交信號(hào)。唯一的差別在于選擇對(duì)小分子RNA分離效率更高的PAGE代替瓊脂糖作為分離膠。MicroRNA基因芯片技術(shù)：即經(jīng)過(guò)標(biāo)記的待測(cè)microRNA與芯片上特定位置的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交，再經(jīng)特定儀器掃描，以計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，并轉(zhuǎn)化為可讀的數(shù)字信息，最后經(jīng)大量數(shù)據(jù)分析篩選出有顯著表達(dá)差異的microRNA。MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR：利用能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)，顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)累積，得到S型的擴(kuò)增曲線；假設(shè)該曲線的前期PCR符合指數(shù)性擴(kuò)增，于是在單純指數(shù)方程的基礎(chǔ)上，通過(guò)比較產(chǎn)物積累的速度來(lái)間接比較初始模板的分子數(shù)。最初，實(shí)時(shí)定量PCR被用于定量檢測(cè)小RNA分子的前體表達(dá)；現(xiàn)在，經(jīng)過(guò)方法改進(jìn)可用于檢測(cè)成熟小RNA分子的表達(dá)?；蛟\斷血常規(guī)（MCV,MCH）基因診斷指利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)體內(nèi)DNA或RNA在結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平上的變化，從而對(duì)疾病做出診斷的方法，通常又稱為分子診斷(MolecularDiagnosis)。lncRNABiomarkerisameasurableindicatoroftheseverityorpresenceofsomediseasestate.Moregenerallyabiomarkerisanythingthatcanbeusedasanindicatorofaparticulardiseasestateorsomeotherphysiologicalstateofanorganism.MolecularbiomarkershavebeendefinedasbiomarkersthatcanbediscoveredusingbasicandacceptableplatformssuchasgenomicsandproteomicsDNApolymorphisms-RFLPDNApolymorphisms-VNTRDNApolymorphisms-SNP核酸分子雜交：來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按照堿基互補(bǔ)關(guān)系形成異源雙鏈分子的過(guò)程。Southern印跡雜交Northern印跡雜交點(diǎn)雜交（Dot-Blot）反向點(diǎn)雜交（ReverseDot-Blot）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。DNA芯片技術(shù)熒光原位雜交比較基因組雜交多重探針連接擴(kuò)增Multiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA)變性高效色譜分析Denaturinghighperformanceliquidchromatography(DHPLC)第一代：雙脫氧核苷酸末端終止法第二代：焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）第三代：?jiǎn)畏肿訉?shí)時(shí)測(cè)序（SingleMoleculeRealTimeSequencing,SMRT)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchennemusculardystrophy）癥狀前診斷（Asymptomaticdiagnosis）產(chǎn)前診斷（Prenataldiagnosis）著床前診斷（Preimplantationdiagnosis）核酸雜交捕獲（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）基因治療基因治療（Genetherapy）廣義概念將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的?；虺C正（genecorrection）對(duì)于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能；基因置換（genereplacement）用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；基因增補(bǔ)（geneaugmentation）將正常基因?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，但致病基因未去除；基因表達(dá)調(diào)節(jié)（modulation）指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術(shù)抑制目的基因表達(dá)從而消除致病基因的作用。自殺基因這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無(wú)細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)傷害作用。免疫基因治療將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。耐藥基因治療在腫瘤化療過(guò)程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。慢病毒(HIV)載體Lentivirus腺病毒載體腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無(wú)包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。痘苗病毒載體：線形雙鏈DNA的有包膜病毒，其核心顆粒不依賴宿主細(xì)胞而獨(dú)立引進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，宿主范圍廣泛且易于培養(yǎng)，容易獲得高滴度的病毒顆粒。同時(shí)痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細(xì)胞的復(fù)制能力，可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個(gè)基因，以表達(dá)多種或一種外源蛋白。脂質(zhì)體載體：是用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體載體無(wú)毒無(wú)抗原性，目的基因與脂質(zhì)體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可單獨(dú)或聯(lián)合其他載體使用，并可通過(guò)靜脈注射使目的基因進(jìn)入特定部位。分子耦聯(lián)載體：由DNA、DNA結(jié)合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結(jié)合，經(jīng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。多聚物載體：是利用帶正電荷的多聚陽(yáng)離子與帶負(fù)電荷的DNA相結(jié)合，形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體相結(jié)合，而被攝入到細(xì)胞中。聚合物聚乙烯亞氨(PEI)：PEI分子量的增加，其對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性同時(shí)增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一種新型多聚物基因載體染色體載體一些參與哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和復(fù)制的染色體成分如轉(zhuǎn)座子、基因隔離子、增強(qiáng)子、基因座控制區(qū)、核骨架結(jié)合區(qū)以及基質(zhì)結(jié)合區(qū)等在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，均被用來(lái)設(shè)計(jì)載體，并整合入基因組而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座子是一類小的DNA片段，可以在染色體不同的區(qū)域移動(dòng)并攜帶遺傳信息；轉(zhuǎn)座子的整合位點(diǎn)具有可預(yù)測(cè)性，從而提高轉(zhuǎn)基因治療的安全性。納米微生物技術(shù)基因治療載體Embryonicstemcells(ES)胚胎干細(xì)胞4~5d胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmassofblastocyst）具有自我更新和分化為任何類型組織細(xì)胞的能力（全能性）Pluripotentstemcells多能干細(xì)胞5~10Wfetus(Embryonicgermcells)外層細(xì)胞→胚胎等與發(fā)育相關(guān)組織內(nèi)細(xì)胞團(tuán)→人體所有器官Specialstemcells專能干細(xì)胞adult(adultstemcells,AS)hematopoieticstemcell(HSC)neuralstemcell(NSC)mesenchymalstemcell(MSC)造血干細(xì)胞Hematopoeiticstemcells（HSC）骨髓間質(zhì)干細(xì)胞Bonemarrowstromalcells（MSC）成纖維細(xì)胞是一種容易獲得和在體外培養(yǎng)并進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞。經(jīng)修飾的細(xì)胞又容易移植回體內(nèi)，必要時(shí)還可將已植入的細(xì)胞重新移走，使其介導(dǎo)的基因治療終止。外周血淋巴細(xì)胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL）小干擾性RNA（siRNA）RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)個(gè)體化醫(yī)學(xué)個(gè)體化醫(yī)學(xué)拷貝數(shù)變異CNV或拷貝數(shù)多態(tài)性CNPGWASDHPLC技術(shù)大題緒論病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能特征病毒基因組基因組很小，且大小相差較大。病毒基因組可以由DNA組成，或由RNA組成。多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的RNA鏈組成；基因重疊?；蚪M的大部分可編碼蛋白質(zhì)，只有非常小的一部份不編碼蛋白質(zhì)。形成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)（polycistronie）。病毒基因組都是單倍體（逆轉(zhuǎn)錄病毒除外）。噬菌體（細(xì)菌病毒）的基因是連續(xù)的，而少數(shù)真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的。原核生物基因組的一般特點(diǎn)基因組較?。?06bp～107bp）。操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的功能單位。結(jié)構(gòu)基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5srRNA及tRNA基因外）。不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內(nèi)（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒(méi)有重復(fù)序列，基因間幾乎沒(méi)有間隔，基因內(nèi)沒(méi)有內(nèi)含子（古細(xì)菌除外）。不編碼部分通常包含調(diào)控基因表達(dá)的序列DNA分子中有各種功能區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū)等，這些區(qū)域往往有反向重復(fù)序列，能形成特殊的結(jié)構(gòu)。真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)1.基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），有兩份同源的基因組。2.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?。一個(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，再翻譯生成一條多肽鏈。3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬(wàn)次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的（斷裂基因，splitgene）6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長(zhǎng)度較小蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilizedpHgradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。1）等電聚焦電泳的基本原理等電聚焦（IEF）是60年代發(fā)展起來(lái)的一種蛋白質(zhì)分析分離手段，如圖所示，在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象稱為等電點(diǎn)聚焦。2）SDS的原理在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)2-DE分離后，凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)須用一定的方法使其顯現(xiàn)出來(lái)，讓儀器或人眼檢測(cè)到。染色方法考馬斯亮藍(lán)染色銀染（不含戊二醛）熒光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素標(biāo)記等二、液相色譜技術(shù)三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過(guò)測(cè)定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過(guò)程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過(guò)一定方法將不同m/z的離子分開，并測(cè)定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。生物質(zhì)譜的組成見PPT42一個(gè)圖哦完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個(gè)保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個(gè)部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。電噴霧質(zhì)譜（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI）為離子源的質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具，因此被稱為生物質(zhì)譜（BMS）。四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)1、基本概念酵母雙雜交技術(shù)(yeasttwo-hybridsystem)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展出來(lái)的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域融合，通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。2、基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)特征。這些蛋白質(zhì)往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨(dú)的BD能與特定基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄。而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)見書P39蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用疾病的蛋白質(zhì)組研究通過(guò)測(cè)定體液和組織的蛋白質(zhì)組,尋找特異疾病的生物標(biāo)記,即疾病特異性蛋白(diseasespecificproteins,DSPs)DSPs水平的變化對(duì)于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點(diǎn)病原微生物的蛋白質(zhì)組研究確定致病菌毒力;尋找新的診斷標(biāo)記物;為疫苗的研制尋找新的候選抗原;闡明藥物抗菌作用機(jī)制與病菌耐藥性發(fā)生機(jī)理,為新的抗生素的研制尋找靶點(diǎn)蛋白質(zhì)組在藥物開發(fā)中的應(yīng)用疾病特異性蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)為藥物設(shè)計(jì)提供了豐富的靶點(diǎn)以DSPs為靶點(diǎn),分析其分子結(jié)構(gòu),定向合成有效藥物成為藥物設(shè)計(jì)的理想模式基因工程基因工程中常用的酶及其作用限制性核酸內(nèi)切酶：簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。限制酶能識(shí)別雙鏈DNA特異的48個(gè)堿基對(duì)，并在此序列內(nèi)特異切割DNA。限制酶功能：根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)上精確切割雙鏈DNA分子?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識(shí)別）DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性：①5→3DNA聚合酶活性②3→5核酸外切酶活性③5→3核酸外切酶活性TaqDNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq酶）是一種耐熱的D