分子生物學(xué)學(xué)習(xí)資料：answer-ch7

7.1描繪一幅大腸桿菌在葡萄糖和乳糖的混合物中成長(zhǎng)的曲線圖，并描述在曲線的各個(gè)階段發(fā)生了什么。答：第一階段，大腸桿菌利用葡萄糖作為C的來(lái)源直至葡萄糖被用盡然后它們停止生長(zhǎng)。接著他們會(huì)在短時(shí)間內(nèi)因?yàn)椴荒苓m應(yīng)新的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境而停止生長(zhǎng)。但是過(guò)了大概一小時(shí)后他們又開(kāi)始了生長(zhǎng)。在這一階段，大腸桿菌會(huì)開(kāi)啟lac操縱子并積聚能夠代謝乳糖的酶。7.2請(qǐng)畫(huà)圖說(shuō)明乳糖操縱子的（1）負(fù)調(diào)控和（2）正調(diào)控。答：（1）負(fù)調(diào)控如圖所示，lacI基因會(huì)表達(dá)生成一個(gè)抑制蛋白（repressor）,起作用的抑制蛋白是一個(gè)四聚體。當(dāng)這個(gè)四聚體結(jié)合到DNA上（operator）時(shí)，就會(huì)阻止RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上，抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。另外DNA上也有基因片段在一定情況下能表達(dá)生成促進(jìn)蛋白（induce）,它可以和抑制蛋白結(jié)合，使其發(fā)生構(gòu)象的改變，以至于抑制子不能結(jié)合到DNA上，因此RNA聚合酶能順利地結(jié)合到啟動(dòng)子，然后開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。（2）正調(diào)控CAP-cAMP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子附近的一個(gè)活性位點(diǎn)（如圖中所示的CAPbindingsite）,促進(jìn)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上，從而對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄其道正調(diào)控的作用。7.3介紹β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的功能。答：圖7.3.1大腸桿菌乳糖操縱子各部分功能示意β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。一般是指能將β-半乳糖苷水解為半乳糖和糖苷的酶。很早以來(lái)，就被認(rèn)為是大腸桿菌誘導(dǎo)酶的典型。分子量54萬(wàn)，為四聚體。其結(jié)構(gòu)基因?yàn)長(zhǎng)acZ。當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)誘導(dǎo)物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞中β-半乳糖苷酶含量很低；但一旦被誘導(dǎo)，則每一世代都能合成多達(dá)幾千個(gè)分子的酶。另外，β-半乳糖苷酶一般廣泛存在于動(dòng)植物界中。圖7.3.2β-半乳糖苷酶的催化反應(yīng)β-半乳糖苷透性酶（galactosidepermease）lacY編碼，是一種分子量為30kDd膜結(jié)合蛋白，構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，通過(guò)改變細(xì)胞膜對(duì)半乳糖的通透性，將半乳糖苷運(yùn)入到細(xì)胞中。7.4為什么說(shuō)lac操縱子的正、負(fù)調(diào)控在大腸桿菌的能量代謝中有重要的作用？答：在大腸桿菌細(xì)胞中，調(diào)控乳糖分解的三種酶的基因轉(zhuǎn)錄是由同一個(gè)啟動(dòng)子控制的，當(dāng)外界條件改變時(shí)它們同時(shí)被啟動(dòng)，又同時(shí)被抑制。這使得細(xì)胞對(duì)外界的反應(yīng)更加敏感。更能有效的應(yīng)對(duì)外界變化。負(fù)調(diào)控使得在乳糖不存在時(shí)編碼這些酶的基因被抑制子阻遏，（通過(guò)抑制子與操縱基因結(jié)合，阻止了RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合）細(xì)胞不能編碼產(chǎn)生這些沒(méi)有用的酶，這使得細(xì)胞中的物質(zhì)不會(huì)被浪費(fèi)。而在乳糖存在的條件下，通過(guò)異乳糖作為一個(gè)誘導(dǎo)物改變抑制子構(gòu)象使其脫離操縱基因，從而RNA聚合酶得以與DNA接合轉(zhuǎn)錄得以實(shí)現(xiàn)。這樣通過(guò)外界條件的指示作用，“告訴”細(xì)胞能夠被利用的能源情況，可以很大程度上減少在沒(méi)有底物時(shí)卻浪費(fèi)細(xì)胞中的成分合成無(wú)用的酶，也能在底物存在時(shí)，讓細(xì)胞有選擇的使用乳糖作為能源。正調(diào)控使得單單乳糖存在這一條件還不足以讓半乳糖苷酶，半乳糖轉(zhuǎn)酰酶和半乳糖透過(guò)酶很好的合成，還需要外界葡萄糖濃度低到一定程度加以支持。因?yàn)榧?xì)胞能夠更有效的利用葡萄糖（單糖），而半乳糖的利用并不是非常劃算，若在還有很多葡萄糖能供利用時(shí)細(xì)胞卻因?yàn)榘肴樘堑拇嬖诙纸獍肴樘?，也是一種不經(jīng)濟(jì)的機(jī)制。所以細(xì)胞需要在葡萄糖含量很低的時(shí)候通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)c-AMP的含量，并使之與分解促進(jìn)蛋白結(jié)合，然后整體結(jié)合到DNA上，促進(jìn)形成開(kāi)放復(fù)合體，從而促進(jìn)RNA的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞中葡萄糖含量高時(shí)，會(huì)抑制c-AMP的產(chǎn)生，從而使這種正向的作用調(diào)解缺少了。從而分解乳糖的酶的基因轉(zhuǎn)錄還不能很活躍，大腸桿菌還是主要有效的利用葡萄糖作為能源，選擇了一條更高效的機(jī)制，又保證了在葡萄糖消耗盡時(shí)還能通過(guò)分解乳糖維持生命。從以上觀之，負(fù)調(diào)節(jié)的作用主要是防止細(xì)胞中資源的浪費(fèi)，而正調(diào)節(jié)的作用主要是選擇一條更有效的資源利用途徑，兩個(gè)機(jī)制都很好的保證了它的能源利用最合理化。7.6描述一個(gè)證明聚合酶在乳糖抑制物已與操縱子結(jié)合的情況下仍能與乳糖啟動(dòng)動(dòng)子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，并預(yù)期結(jié)果。答：實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：（1）取三個(gè)器皿編號(hào)1、2、3，并加入等體積含有等量包括乳糖啟動(dòng)子的DNA片段的溶液。（2）在2、3中加入含有乳糖阻抑物的溶液，在1中加等量蒸餾水。（3）在乳糖抑制物與DNA結(jié)合后，加入RNA聚合酶，反應(yīng)20分鐘，使形成開(kāi)放的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。（4）加肝素以阻止任何新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，并加入除CTP以外的所有反應(yīng)物，培養(yǎng)5分鐘。（5）加入用標(biāo)記的CTP，在3中加入誘導(dǎo)物IPTG，在1、2中加入等量蒸餾水，反應(yīng)10分鐘以合成RNA。（6）電泳轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，電泳時(shí)在不同泳道中加入相應(yīng)編號(hào)的器皿中的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期： 1、3道中應(yīng)該在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物位置有帶，2中沒(méi)有。因?yàn)樵诘?步中加了肝素以阻止任何新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，在3中有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所以在第3步有乳糖阻抑物存在時(shí)必形成了轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，說(shuō)明聚合酶在乳糖阻抑物已與操縱子結(jié)合的情況下仍能與乳糖啟動(dòng)動(dòng)子結(jié)合。7.7簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果以說(shuō)明乳糖抑制子阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子相結(jié)合.答：由圖可以說(shuō)明RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合是一個(gè)平衡過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)中使用末端磷酸帶標(biāo)記的CTP參加轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這樣，產(chǎn)物焦磷酸的放射性含量就反映了轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行程度。在實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)時(shí)間與放射含量正相關(guān)，但當(dāng)加入肝素或者抑制子時(shí)，放射性含量很快不再增加，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄得到抑制，而肝素的作用是與聚合酶結(jié)合，阻止其與啟動(dòng)子結(jié)合。自然地可假設(shè)抑制因子正是與操縱子結(jié)合，從而與聚合酶相互作用，使其不能與啟動(dòng)子作用。7.8我們?nèi)绾蔚弥齻€(gè)opereator對(duì)基因的完全表達(dá)是必須的？移去輔助operator中的一個(gè)或兩個(gè)，對(duì)基因表達(dá)有什么影響？答：從圖7.8中可看出，只有主操縱子O1,只能產(chǎn)生18倍的抑制，而O1和輔操縱子O2或O3可產(chǎn)生較高水平的抑制，而三者多存在時(shí)，抑制水平達(dá)最高，所以說(shuō)三個(gè)opereator對(duì)基因的完全表達(dá)是必須的。去除兩輔助操縱子對(duì)基因表達(dá)的影響也可直接從圖中的出：去除兩輔助操縱子之一，是抑制水平稍微降低，但若兩輔助操縱子完全去除，使抑制水平降低了50倍。圖7.8三個(gè)操縱子上變異的影響。分別將野生型和變異型的lacoperon片段載入λ噬菌體DNA，讓這些噬菌體DNA浸染大腸桿菌細(xì)胞，插入其染色體。引入的lac片段包含operator、lacpromoter,lacZgene。E.coli細(xì)胞不含lzcZ基因，但有l(wèi)acI基因。通過(guò)分析β-galactosidase的水平測(cè)定表達(dá)受抑制的水平7.9描述一個(gè)通過(guò)野生型CAP和變異型CAP（使cAMP與CAP之間的親合力減?。﹣?lái)表現(xiàn)cAMP對(duì)β-牛乳糖合成的促進(jìn)作用的實(shí)驗(yàn)，并給出相應(yīng)的結(jié)論。答：Fig7.14野生型CAP和變異型的CAP與cAMP對(duì)β-牛乳糖合成的促進(jìn)作用圖Pastan和他的同事們讓細(xì)菌提取液分別在野生型CAP和變異型CAP的條件下，同樣地增大兩者的cAMP濃度，觀察各自的β-牛乳糖的合成情況。紅色表示野生型CAP與cAMP對(duì)β-牛乳糖合成的促進(jìn)作用，而綠色表示cAMP與CAP之間的親合力減小的變異型CAP與cAMP對(duì)β-牛乳糖合成的促進(jìn)作用。從圖中可以看出變異型CAP與cAMP對(duì)β-牛乳糖合成的促進(jìn)作用明顯不如野生型的，這也就證明了CAP與cAMP的結(jié)合體才是乳糖操縱子的促進(jìn)因子（而不單是cAMP）。7.10提出假說(shuō)來(lái)說(shuō)明CAP-cAMP如何激活Lac基因的轉(zhuǎn)錄，并說(shuō)明其中聚合酶α亞基的C末端在其中的作用。答：CAP-cAMP的Activatorsite位于RNA聚合酶啟動(dòng)子的上游，相當(dāng)于UPelement，當(dāng)CAP-Camp二聚物結(jié)合到Activatorsite后，促使RNA聚合酶結(jié)合到LacYZA結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子上。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)去除а―subunit的CTD后，RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄水平和不被激活是沒(méi)有很大的區(qū)別，而完整的RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)提高很多。這說(shuō)明а―subunit的CTD對(duì)于促進(jìn)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上有很大的作用。當(dāng)培養(yǎng)集中的葡萄糖含量很高的情況下，cAMP的含量很低，因此即使沒(méi)有抑制物的情況下，由于Lac的啟動(dòng)子是一個(gè)弱的啟動(dòng)子，其基本的轉(zhuǎn)錄水平很低。當(dāng)葡萄糖的含量很低的情況下，cAMP的含量上升，cAMP和CAP結(jié)合形成復(fù)合物，兩個(gè)這樣的復(fù)合物形成二聚替他們一起結(jié)合到Activatorsite上，促進(jìn)RNA聚合酶和DNA形成closedpromotercomplex。這樣轉(zhuǎn)錄水平很高。LacZYA的啟動(dòng)子沒(méi)有UPelement，是一個(gè)弱的啟動(dòng)子，由圖我們知道當(dāng)CAP-cAMP復(fù)合物的二聚體結(jié)合到Activatorsite后先黨與UPelement和а―subunit的CTD作用，轉(zhuǎn)錄水平提高很多。證明二者相互作用的實(shí)驗(yàn)：（1）去掉α-subunit的CTD后即使有CAP-cAMP轉(zhuǎn)錄水平也很低；（2）Activatorsite和-35、-10box的距離很近；（3）通過(guò)DNasemapping發(fā)現(xiàn)CAP-cAMP復(fù)合物的作用位點(diǎn)和RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)距離很近（4）可以通過(guò)突變補(bǔ)償?shù)姆椒ㄊ莾蓚€(gè)都改變的CAP-cAMP復(fù)合物和α-subunit的CTD起到和未突變前相同的作用。7.11描述并給出顯示CAP-cAMP結(jié)合在lac啟動(dòng)子區(qū)域后使其彎曲的電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：圖7.11驗(yàn)證CAP-cAMP-promoter復(fù)合體使啟動(dòng)子彎曲的電泳實(shí)驗(yàn)圖用不同的限制性?xún)?nèi)切酶可以從不同的作用位點(diǎn)切開(kāi)環(huán)狀DNA，使啟動(dòng)子位于所切DNA不同的位置。由于DNA電泳時(shí)的遷移速度與彎曲發(fā)生的位置有關(guān)，彎曲位點(diǎn)越靠近中間，其遷移速度越慢。所以如果DNA真的由于CAP-cAMP和啟動(dòng)子的結(jié)合而彎曲，則不同酶所切出的產(chǎn)物會(huì)有不同的遷移速度，如圖a,b。真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖d，可以看出CAP-cAMP的結(jié)合確實(shí)使lac啟動(dòng)子發(fā)生了彎曲，且從數(shù)據(jù)的分析中我們可以判斷啟動(dòng)子的位置所在。7.12還有什么證據(jù)證明因CAP-cAMP結(jié)合到DNA上而使得DNA彎曲？答：當(dāng)操縱子的激活位點(diǎn)在啟動(dòng)子上游較遠(yuǎn)的位點(diǎn)時(shí)，DNA就必須彎曲從而使得CAP與RNA聚合酶相互作用。證明CAP-cAMP在DNA上的結(jié)合使得DNA彎曲的證據(jù)有以下幾個(gè)：1)對(duì)被不同酶切的質(zhì)粒進(jìn)行電泳。如圖7.12.1。當(dāng)DNA彎曲時(shí)，它在電泳中移動(dòng)的速度就會(huì)減慢，彎曲越靠近中部移動(dòng)速度越慢。如圖中（a）紅色部分是CAP的結(jié)合位點(diǎn)，1、2、3、4分別是四種酶的酶切位點(diǎn)，（b）是對(duì)質(zhì)粒分別用四種酶切后的圖示，已經(jīng)有CAP結(jié)合在DNA上使其彎曲了。對(duì)（b）中四種酶切后的DNA進(jìn)行電泳，則由前可知若DNA因CAP的結(jié)合而彎曲，四種DNA移動(dòng)速度應(yīng)不相同，移動(dòng)速度大小關(guān)系為1<2=4<3，若DNA未彎曲則速度應(yīng)相同。電泳后的速度關(guān)系如7.12.1中（c）所示，說(shuō)明DNA確實(shí)因?yàn)镃AP的結(jié)合而彎曲了。Fig7.12.1結(jié)合CAP的DNA的電泳2）X光晶體結(jié)構(gòu)圖。從圖7.12.2的DNA與CAP的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)圖可以很明顯地看出，由于CAP的結(jié)合而使得DNA有了一個(gè)九十四度的彎曲。這是對(duì)CAP的結(jié)合使DNA彎曲的直接證據(jù)。圖7.12.2DNA與CAP的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)圖。Fig7.12.3CAP-cAMP與DNA復(fù)合物的X光晶體結(jié)構(gòu)圖3）替代彎曲的方法。若CAP-cAMP與DNA結(jié)合能引起DNA彎曲而促進(jìn)啟動(dòng)子開(kāi)放復(fù)合體的形成，則如果無(wú)CAP結(jié)合，但改變DNA體部分結(jié)構(gòu)使其在何時(shí)位點(diǎn)上形成彎曲結(jié)構(gòu)，也應(yīng)該能促進(jìn)啟動(dòng)子開(kāi)放復(fù)合體的形成。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將lac操縱子上的CAP結(jié)合位點(diǎn)改成（dA）.（dT）,而使DNA無(wú)CAP結(jié)合時(shí)自己彎曲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)也能促進(jìn)啟動(dòng)子開(kāi)放復(fù)合體的形成。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，CAP-cAMP的結(jié)合可以使的DNA彎曲。7.13給出一個(gè)模型并解釋為什么DNA的彎曲可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。答：首先，這種結(jié)合會(huì)使CAP上的聚合酶結(jié)合位點(diǎn)調(diào)整成合適的狀態(tài)來(lái)與聚合酶結(jié)合，從而將它吸引到啟動(dòng)子上(比如CAP-lac-promoter)。另一種把聚合酶引到啟動(dòng)子的方法是用DNA結(jié)合的方法引起DNA纏繞在聚合酶上，使上游的結(jié)合位點(diǎn)與酶能夠接觸到（比如arapeomoter）。7.14簡(jiǎn)述CAP(cataboliteactivatorprotein，代謝產(chǎn)物激活子蛋白)激活麥芽糖調(diào)控子(maltoseregulon)的作用模型。答：大腸桿菌麥芽糖調(diào)控子中含有多個(gè)基因和相應(yīng)的啟動(dòng)子(promoter)序列，其中部分啟動(dòng)子受MalT（另一種調(diào)控蛋白）的控制，部分啟動(dòng)子受CAP控制，還有兩個(gè)啟動(dòng)子(malEp和malKp)受MalT和CAP的雙重控制。這里以最后一種為例說(shuō)明CAP的作用模型。在DNA上，啟動(dòng)子malEp和malKp啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的方向是相反的，兩者之間相隔271個(gè)堿基對(duì)（見(jiàn)圖7.14.1）。兩者間有5個(gè)MalT結(jié)合位點(diǎn)（紅色）和3個(gè)CAP結(jié)合位點(diǎn)（藍(lán)色）。圖7.14.1啟動(dòng)子malEp和malKpMalT結(jié)合位點(diǎn)3、4、5實(shí)際上分別是兩個(gè)各相差3個(gè)堿基對(duì)而互相重疊的MalT結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)圖7.14.2）。當(dāng)CAP不存在時(shí)，MalT優(yōu)先結(jié)合到3、4、5位點(diǎn)上。但這三個(gè)位點(diǎn)并非起始轉(zhuǎn)錄的最佳位置——在這三個(gè)位置上MalT沒(méi)有與啟動(dòng)子的-10序列正確定位。當(dāng)CAP結(jié)合到自己的結(jié)合位點(diǎn)上后，CAP與MalT的相互作用可將3、4、5位點(diǎn)上的MalT分別移動(dòng)3個(gè)堿基對(duì)的位置而推到3’、4’、圖7.14.2啟動(dòng)子malEp和malKp之間的MalT結(jié)合位點(diǎn)7.15給出問(wèn)題14中所提出模型的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。答：1)沒(méi)有CAP結(jié)合位點(diǎn)的突變型（malKpΔ104）存在不同的MalT結(jié)合位點(diǎn)，因而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比野生型少。2)對(duì)以上的突變型進(jìn)一步突變會(huì)使MalT結(jié)合在其他位點(diǎn)進(jìn)而重新獲得一部分活性。3)在5~-10box之間刪除三個(gè)堿基對(duì)會(huì)使得3，4，5位點(diǎn)完美地與啟動(dòng)子結(jié)合，這樣就可以重獲活性。4)DNase，DMS，oxygenradical三種footprinting方法可以給出更為詳細(xì)的證據(jù)。7.16請(qǐng)解釋以下現(xiàn)象并用圖表示例：在araBAD操縱子中的araO2和araI位點(diǎn)之間插入整數(shù)倍DNA螺旋（即10.5bp的整數(shù)倍）的序列仍然可以由AraC抑制轉(zhuǎn)錄；但如果插入非整數(shù)倍DNA螺旋的序列則這種抑制作用消失。答：AraC與araO2和araI1分別結(jié)合，抑制了araPBAD。其原理如下圖：雙鏈DNA可以形成一個(gè)彎曲結(jié)構(gòu)，將兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)拉在一起，結(jié)合在DNA上的蛋白質(zhì)即可相互作用，使這個(gè)彎曲結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。從而達(dá)到兩個(gè)相距較遠(yuǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)共同作用的效果。但前提是這兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)必須在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的同側(cè)，因?yàn)镈NA就如同鋼絲，可以彎曲但無(wú)法扭曲。因此，如果在araO2和araI位點(diǎn)之間插入整數(shù)倍的DNA螺旋（即10.5bp的整數(shù)倍）的序列，兩個(gè)AraC結(jié)合位點(diǎn)仍可保證在DNA螺旋的同側(cè)；但如果插入非整數(shù)倍DNA螺旋，兩個(gè)AraC結(jié)合位點(diǎn)將會(huì)在螺旋的不同側(cè)，如上圖右所示。此時(shí)雙螺旋DNA由于無(wú)法扭曲，不能使兩個(gè)AraC相互作用，也就無(wú)法達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄的效果。7.18描述一個(gè)實(shí)驗(yàn)證明阿拉伯糖可破壞AraC形成的抑制環(huán)（loop），并給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：這個(gè)實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)部分組成。第一部分，將阿拉伯糖加入已形成抑制環(huán)微環(huán)物（minicircle）中，同時(shí)用不加阿拉伯糖的微環(huán)物做對(duì)照，培養(yǎng)并進(jìn)行電泳分析。第二部分，用已形成抑制環(huán)的微環(huán)物進(jìn)行電泳，在電泳開(kāi)始后，在一個(gè)泳道中加入阿拉伯糖，另一個(gè)不加以做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)可得以下結(jié)果：第一部分，如圖（a）所示，第四道為微環(huán)物加入阿拉伯糖后的圖像，由圖可知，加入阿拉伯糖后，抑制環(huán)消失，微環(huán)物電泳移動(dòng)速率變慢；第二泳道為沒(méi)有加阿拉伯糖的微環(huán)物，由圖可知，抑制環(huán)存在，電泳速率較快。第二部分，如圖（b）所示，第四道為電泳開(kāi)始時(shí)未加阿拉伯糖，則抑制環(huán)存在；第四道為電泳開(kāi)始后加入阿拉伯糖，則抑制環(huán)消失。由這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以證明阿拉伯糖能破環(huán)抑制環(huán)。7.19描述一個(gè)應(yīng)用araO2和araI來(lái)形成抑制環(huán)的實(shí)驗(yàn)并給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：實(shí)驗(yàn)是由Lobell和Schlief做的，他們先用電泳證明了在沒(méi)有樹(shù)膠醛糖的情況下AraC可以導(dǎo)致環(huán)的形成。他們用一個(gè)DNA的小型超螺旋環(huán)來(lái)代替整個(gè)大腸桿菌的DNA，這種叫作minicircle的小型超螺旋環(huán)含有araO2和araI。然后他們加入了AraO2并且利用成環(huán)的超螺旋DNA比未成環(huán)的更劇具電泳能力來(lái)測(cè)定成環(huán)情況。實(shí)驗(yàn)表明所成環(huán)的穩(wěn)定性與AraC和araO2，araI的結(jié)合有關(guān)。7.20描述一個(gè)實(shí)驗(yàn)證明消除阿拉伯糖可以使被打開(kāi)的抑制環(huán)重新成環(huán)，并給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：1）首先，Lobell和Schleif通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了AraC可以促使DNA形成抑制ara操縱子作用的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及arabinose（阿拉伯糖）可以打開(kāi)這種抑制環(huán)這兩點(diǎn)，這是進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)的前提。2）接著，Lobell和Schleif利用實(shí)驗(yàn)證明了消除阿拉伯糖可以使被打開(kāi)的抑制環(huán)重新成環(huán)，具體過(guò)程如下：a.用AraC使經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DNA成環(huán)（該步驟中溶液內(nèi)不含阿拉伯糖）；b.加入過(guò)量未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA；c.加入阿拉伯糖，使抑制環(huán)打開(kāi)；d.用含有阿拉伯糖的緩沖液去稀釋DNA；e.用另一份不含阿拉伯糖的緩沖液去稀釋上一步驟所得的溶液（中的阿拉伯糖）f.電泳成像3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖：照片上方的圖表也表明了該實(shí)驗(yàn)的過(guò)程，電泳顯示結(jié)果如下：泳道1：向標(biāo)記過(guò)的DNA溶液中加入競(jìng)爭(zhēng)性DNA而未加AraC——沒(méi)有檢測(cè)到環(huán)狀復(fù)合體泳道2：向標(biāo)記過(guò)的DNA溶液中依次加入AraC和競(jìng)爭(zhēng)性DNA——檢測(cè)到穩(wěn)定的環(huán)狀復(fù)合體泳道3，4：向已成環(huán)的DNA溶液中加入含有競(jìng)爭(zhēng)性DNA和阿拉伯糖的緩沖液——復(fù)合體穩(wěn)定性明顯下降，環(huán)被打開(kāi)泳道5，6：用不含阿拉伯糖的緩沖液稀釋前一溶液中的阿拉伯糖——復(fù)合體重新成環(huán)4)結(jié)論：以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，消除阿拉伯糖可以使被打開(kāi)的抑制環(huán)重新成環(huán)。7.21描述一個(gè)實(shí)驗(yàn)并寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。要求該實(shí)驗(yàn)?zāi)苷f(shuō)明在開(kāi)放DNA（unlooped）而不是彎曲DNA(looped)中，araI2元件對(duì)AraC調(diào)節(jié)因子的結(jié)合起重要作用。答：實(shí)驗(yàn)中采用只含阿拉伯糖操縱子的超螺旋環(huán)狀DNA（minicircle），大約含404個(gè)堿基對(duì)。圖7.21.1阿拉伯糖操縱子的彎曲與開(kāi)放形態(tài)同時(shí)實(shí)驗(yàn)中采用araI2元件突變體與野生型的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，先加入AraC使DNA彎曲(looped)，然后加入阿拉伯糖，觀察各實(shí)驗(yàn)組能否改變至開(kāi)放態(tài)，同時(shí)為了能做出更清晰的區(qū)分條帶，加入限制酶Hind=3\*ROMANIII使環(huán)狀DNA打開(kāi)為線性，便于電泳分離。圖7.21.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)計(jì)（a）AraC存在情況下，加入阿拉伯糖，野生型中的開(kāi)放式DNA不斷增加，說(shuō)明基因形態(tài)從彎曲型（looped）向開(kāi)放型（unlooped）轉(zhuǎn)變；而在araI2元件突變體中則不存在這一轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，說(shuō)明araI2元件的不正常使AraC只能與araI1及araO2元件結(jié)合，DNA始終處于彎曲狀態(tài)。（b）為使上述結(jié)果更為明顯，使用限制酶Hind=3\*ROMANIII，將環(huán)狀的DNA切成直線型，是電泳結(jié)果更為明顯，在野生型中出現(xiàn)了開(kāi)放DNA的條帶，而araI2元件突變體中不存在。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們就可以發(fā)現(xiàn)，araI2元件與AraC的結(jié)合，是產(chǎn)生于開(kāi)放形態(tài)（unlooped）DNA，而不是彎曲形態(tài)（looped）。7.22提出一個(gè)模型并解釋trp操縱子的負(fù)調(diào)