一種登革熱病毒雙靶基因多重?zé)晒鈖cr檢測方法的建立

一種登革熱病毒雙靶基因多重?zé)晒鈖cr檢測方法的建立

病毒登格熱是由病毒通過蚊子傳播引起的急性發(fā)熱性疾病。根據(jù)病毒特征的結(jié)構(gòu)特征，可分為四種類型：t、t、h和t。登革熱病毒主要在亞洲、非洲和南美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)流行。感染登革熱病毒后主要引起癥狀較輕的登革熱,但少數(shù)病例會出現(xiàn)登革出血熱,甚至在不及時治療的情況下出現(xiàn)死亡。由于登革熱是一種蚊傳播疾病,一旦在某一地區(qū)發(fā)生,極容易傳播擴(kuò)散。登革熱在全球100多個國家發(fā)生過流行,25億人具有感染的風(fēng)險,每年大約有5000萬人感染登革熱病毒,我國南方地區(qū)也經(jīng)常有血清檢測陽性以及病毒分離情況的文獻(xiàn)報道。感染一種登革熱病毒型別后可以對該型登革病毒產(chǎn)生終生免疫,但不能對其他型別產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。登革熱的嚴(yán)重癥狀——登革出血熱與登革熱病毒型別有關(guān),再次感染其他型別的登革熱病毒是導(dǎo)致登革出血熱的原因之一。目前還沒有一種有效的疫苗防治登革熱的發(fā)生,其防治工作非常困難。因此,對登革病毒進(jìn)行快速檢測和分型,對登革熱的臨床診斷和綜合防治具有重要意義。本研究設(shè)計了一種登革熱病毒多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系,可快速準(zhǔn)確地對登革熱病毒進(jìn)行檢測和分型。1材料和方法1.1檢驗評論員3實驗室惠饋登革熱病毒4個基因型標(biāo)準(zhǔn)株提取物由廣東出入境檢驗檢疫局P3實驗室惠贈。陽性樣本為20例登革熱病毒病人急性發(fā)作期提取的核酸標(biāo)本;陰性對照來自20例正常無癥狀人群標(biāo)本。1.2主要設(shè)備實驗所使用儀器設(shè)備為美國ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀、EPPENDORF冷凍離心機(jī)。1.3熒光rtpcr反應(yīng)試劑柱式病毒RNA提取試劑購自德國QIAGEN公司;DRR064A熒光RTPCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物公司;其他生化試劑和引物探針合成物購自上海生工生物工程公司。1.4整體推進(jìn)qaamprna提取柱的制備采用QIAGEN病毒RNA提取試劑盒,將560μ1準(zhǔn)備好的含有CarrierRNA的AVL緩沖液加入1.5ml離心管;取血清140μl,室溫(15~25℃)孵育10min;將1.5ml離心管短暫離心,消除管蓋內(nèi)的液滴;加入560μl乙醇,震蕩混勻15s;將離心管短暫離心,消除管蓋內(nèi)的液滴;將630μl上一步驟中的溶液小心轉(zhuǎn)入QIAampRNA提取柱,注意不要碰濕柱子邊緣。蓋上蓋子,6000×g離心1min。將柱子移入一新的2ml收集管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開柱子的蓋子,重復(fù)上一步驟1次;加入500μlAW1液,蓋上蓋子,6000×g離心1min。將柱子放入一新的2ml收集管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開柱子的蓋子,加入500μlAW2液,蓋上蓋子,全速20000×g離心3min;將柱子放入一新的1.5ml離心管,丟棄剩有濾液的收集管;小心打開柱子的蓋子,加入60μl已平衡至室溫的AVE緩沖液,蓋上蓋子,室溫孵育1min,6000×g離心1min。收集核酸于4~8℃保存?zhèn)溆谩?.5熒光pcrroxrewelledpreact反應(yīng)體系采用DRR064A熒光RTPCR反應(yīng)試劑,總體積25μl。2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μl,TaKaRaExTaq誖HS(5U/μl)0.5μl,PrimeScript誖RTEnzymeMixⅡ0.5μl,RNaseFreedH2O1.5μl,ROXReferenceDyeII(50×)0.5μl,上游引物(40μmol/L)各0.5μl,下游引物(40μmol/L)各0.5μl,探針(10μmol/L)各0.5μl,RNA模板5μl(引物和探針序列見表1,引物濃度為40μmol/L,探針濃度為10μmol/L,登革Ⅰ型和Ⅲ型探針用FAM-TAMARA標(biāo)記,登革Ⅱ型和Ⅳ型探針用JOE-TAMARA標(biāo)記,登革通用型探針用CY5-BHQ2標(biāo)記)。反應(yīng)條件:42℃8min;95℃10s,95℃5s,60℃34s,45個循環(huán));退火溫度按55~60℃間隔1℃分別試驗優(yōu)化,退火溫度為60℃時,反應(yīng)曲線呈典型的S型,熒光信號最強(qiáng),本實驗選擇60℃作為退火溫度進(jìn)行下面的所有熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系中一個樣本分別同時在2個反應(yīng)管中進(jìn)行,一個反應(yīng)管中的引物探針為Ⅰ、Ⅱ和通用型,另一管中的引物探針為Ⅲ、Ⅳ和通用型,其他反應(yīng)條件和試劑成分比例不變。1.6多重?zé)晒鈖cr檢測分別用登革熱病毒4個基因型以及DEPC處理水、特異性引物PCR實驗證實為HIV、HCV、HEV的RNA提取物為對照模板進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測,以評價實驗的特異性。1.7depcr檢測對四型登革病毒陽性RNA樣本以10倍梯度用DEPC處理水進(jìn)行稀釋,最大稀釋倍數(shù)108,然后以各稀釋液為模板進(jìn)行PCR檢測,反應(yīng)體系為各型登革病毒對應(yīng)的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系。1.8熒光pcr反應(yīng)體系檢測選擇檢測限性實驗中可檢測到熒光信號的梯度稀釋樣本,用對應(yīng)的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系重復(fù)檢測4次。統(tǒng)計各型樣本不同稀釋度的CT平均值和變異系數(shù)。1.9樣品檢測采用本研究建立的多重?zé)晒釶CR檢測方法對20例陽性核酸標(biāo)本和20例正常無癥狀人群標(biāo)本提取的核酸進(jìn)行檢測。2結(jié)果2.1測通道的陽性反應(yīng)及陰性對照登革熱病毒4個基因型模板在相應(yīng)檢測通道呈典型的陽性反應(yīng)曲線,HIV、HCV和HEV的RNA提取物作為陰性對照模板均為陰性反應(yīng)(圖1)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限各型登革熱病毒隨著稀釋倍數(shù)的增大,檢測CT值增大,稀釋至105時均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,106以上時未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,經(jīng)測試計算最低檢測限相當(dāng)于103copies/ml。以登革熱病毒I型RNA梯度稀釋的擴(kuò)增結(jié)果為例,擴(kuò)增曲線如圖2。2.3型登革熱病毒rna的ct值將四型登革熱病毒RNA進(jìn)行10、102、103、104稀釋重復(fù)檢測4次,Ⅰ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.6、19.1、22.6、25.9,變異系數(shù)依次為0.56%、0.67%、0.60%、0.96%;Ⅱ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.5、19.3、22.4、25.6,變異系數(shù)依次為0.71%、0.32%、0.55%、0.86%;Ⅲ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為17.2、20.3、22.9、26.1,變異系數(shù)依次為1.63%、1.56%、1.83%、2.91%;Ⅳ型登革熱病毒RNA的CT均值依次為16.8、20.1、23.2、25.8,變異系數(shù)依次為1.66%、1.92%、2.18%、2.65%;登革通用型RNA的CT均值依次為16.9、20.6、23.1、26.5,變異系數(shù)依次為0.56%、1.28%、2.16%、2.06%;以Ⅰ型為例,倍比稀釋的重復(fù)試驗結(jié)果見圖3。2.4不同類型病毒的分型20個登革熱陽性核酸標(biāo)本在通用型檢測全部為陽性,特異性型別檢測發(fā)現(xiàn)登革熱病毒Ⅰ型10例、登革熱病毒Ⅱ型3例、登革熱病毒Ⅲ型3例、登革熱病毒Ⅳ型4例。20名正常無癥狀人群標(biāo)本提取的核酸通用型和特異性型別檢測全部為陰性。3登革熱實時熒光pcr檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀臨床診斷過程中通常以血清學(xué)登革熱特異性抗體的檢測試驗作為病毒感染的重要指標(biāo)。基于ELISA檢測原理的抗登革熱免疫球蛋白(IgM)的存在預(yù)示著近期發(fā)生的登革熱病毒感染。然而,抗登革熱IgM只有在疾病發(fā)生的5d左右后被檢測到,延誤早期診斷。此外,抗登革熱IgM抗體可以持續(xù)數(shù)月。除非連續(xù)的樣品進(jìn)行了測試,進(jìn)行滴度對比才具有臨床診斷價值,而且抗登革熱IgM與其他黃病毒的交叉反應(yīng)也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)的問題。PCR檢測能夠直接檢測病原體的靶核酸,是病毒物質(zhì)快速檢測的重要工具,與其他檢測方法比較可以提前5~8d檢測窗口期感染情況。因此,許多學(xué)者在探索基于PCR原理方面的登革熱病毒快速檢測方法。實時熒光PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來的新技術(shù),不僅具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點,而且由于該法采用引物和探針的雙重選擇作用,因此特異性更強(qiáng),可避免普通PCR技術(shù)帶來的假陽性反應(yīng)。本研究顯示,實時熒光PCR不但可以檢測單個靶基因,而且能實現(xiàn)任意2個甚至多個靶基因的同時檢測,在檢測領(lǐng)域越來越受重視。同時多重?zé)晒釶CR的檢測靈敏度與單重?zé)晒釶CR的檢測靈敏度無明顯差異,本研究中選擇了FAM、JOE、CY5這三種主波長差異較大的標(biāo)記物,從而有效防止不同靶基因檢測結(jié)果可能產(chǎn)生的相互干擾。本研究建立的對同一樣本特異性型別基因和通用型基因雙靶基因多重?zé)晒釶CR檢測方法能夠?qū)Φ歉餆岵《靖咄靠焖勹b定。雙靶基因檢測中,通用型引物探針用于篩查檢測,特異性型別引物探針用于檢測分型,這樣可以提高登革熱的檢測靈敏度,避免因某個基因區(qū)域的變異出現(xiàn)漏檢情況。國內(nèi)外登革熱實時熒光PCR檢測技術(shù)主要為單一每個型別分別檢測或只進(jìn)行通用型檢測而不