耐藥結核分枝桿菌基因突變檢測方法的建立

耐藥結核分枝桿菌基因突變檢測方法的建立

本研究中，我們提出了一種通過pcr-scp技術建立抗結果桿菌藥物遺傳因素的檢測方法，分析了108例臨床抗炎劑的突變，并對抗炎桿菌基因突變是否與臨床藥物的耐藥性有關。1材料和方法1.1培養(yǎng)基藥敏試驗108例臨床耐藥株源于我院住院患者痰標本,經Bactec-960培養(yǎng)和羅氏培養(yǎng)基不同梯度藥敏試驗。鏈霉素(SM)、利福平(RFP)、異菸肼(INH)高濃度含量分別依次為4.0,400,2.0mg/L。低濃度含量分別依次為0.4,40,0.2mg/L。同時按“結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程”進行菌種鑒定。1.2試劑結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒由本院結核病分子生物學實驗室提供。7H9培養(yǎng)基由美國BD公司提供。羅氏藥敏培養(yǎng)基為本室自制。1.3sscp分析將痰液標本前處理后,一部分進行藥敏試驗。另一部分進行Bactec-960培養(yǎng)后,提取DNA,至-20°C保存?zhèn)溆谩CR擴增:按試劑盒說明書進行操作,擴增分枝桿菌耐SM基因rpsl產生267片段;耐RFP基因rpoB產生232bp片段,耐INH基因katG產生273bp片段。SSCP分析:將臨床分離株與結核分枝桿菌標準株的DNAPCR擴增產物加在同一塊8%(29∶1)非變性聚丙烯酰胺凝膠中,于4°C100～120v電泳6h,銀染色后觀察結果并照相。結果判定:雙鏈PCR產物經變性后形成兩條單鏈,經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后呈現兩條單鏈帶。若所呈現的單鏈帶位置與野生型不同,稱為泳動變位,即可判定存在基因突變。2結果2.1inh和rfp基因敏感株108株臨床標本中耐SM有98株,其中高耐株84株,低耐株有14株;10株為SM敏感株;耐INH有78株,其中高濃度耐INH有66株,低濃度耐INH有12株,有30株為INH敏感株。108例中有耐RFP78株,高濃度耐RFP有64株,低濃度耐RFP有14株,有32株為敏感株。(見表1)。2.2抗sm和rfp突變在108例結核分枝桿菌(TB)耐SM、RFP、INH株中,rpsl基因擴增均產生267bp片段;rpoB均產生232bp片段,INH均產生237bp片段。以TB標準株DNA擴增產物為對照,98例耐SM分離株,有77株SSCP分析出現泳動變位的rpsl基因突變,SM總突變率為78.5%(77/98)。66株耐RFP高耐株中,59株SSCP分析出現泳動變位,12例低耐RFP分離株中,2株SSCP出現泳動變位的rpoB基因突變,耐RFP總突變率為78.2%(61/78)。耐INH高耐株64例中有54株SSCP分析出現泳動變位,低耐INH14例中有1株出現泳動變位的katG基因突變,耐INH總突變率為70.5%(55/78)(見表1)。2.33sm、rfp、inh高、低耐藥試驗和耐藥結構特征耐SM(rpsl),REP(rpoB),INH(katG)基因突變的原理分別為:RFP抗結核作用機制是通過與結核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位的結合,干擾轉錄的開始和RNA延伸。編碼β亞單位的基因被命名為rpoB。結核分枝桿菌耐RFP的機制理論上有兩種可能:一是藥物作用靶分子RNA聚合酶β亞單位的突變。二是細胞壁滲透性改變導致藥物攝入減少。在試驗108例耐藥臨床標本中有11例高耐株和10例低耐株未突變,可能是屬于第二種情況,或存在其它耐藥機制。高耐藥株突變占總突變數的86.9%,低耐藥株占28.5%。SM主要作用于結核分枝桿菌的核糖體,誘導遺傳密碼的錯讀,抑制mRNA轉譯的開始,干擾轉譯過程中的校對,從而抑制蛋白質合成。最近研究認為某些菌株耐SM是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsl或16srRNA編碼基因rrs突變所致,雖然rrs突變也會導致部分結核分枝桿菌耐SM,但rpsl突變是SM耐藥的主要分子機制。傳統藥物梯度敏感試驗證實,耐SM基因突變株絕大多數發(fā)生在高耐藥菌株占89.3%,有4例在低耐區(qū)發(fā)生突變,可能因PCR-SSCP實驗敏感,低耐區(qū)開始出現少量高耐菌株的基因突變就被檢測出來,其它原因有待今后研究。異煙肼(INH)是酰肼類化學合成藥物,結核分枝桿菌對其高度敏感,但是也易產生耐藥。最近研究表明,結核分枝桿菌耐INH可能與過氧化氫酶—過氧化物酶編碼基因katG和烯?；€原酶編碼基因inhA或烷基過氧化氫酶編碼基因ahpc改變有關,50%～70%的結核分枝桿菌耐INH分離株katG有突變,與本研究70.5%相同(見表)。其中,高耐藥株有54株,占總突變的84.3%,僅有一株在低耐藥株突變。1992年,Zhang等首次從基因水平上對結核分枝桿菌INH耐藥性進行研究,發(fā)現在3株MIC≥50μg/ml的高濃度耐藥株中,有2株完全缺失katG基因,認為結核分枝桿菌中katG基因的完全缺失導致了過氧化物酶不被表達,從而引起結核分枝桿菌耐藥性。而8株高耐藥性的katG基因突變,更證實與INH耐藥性有關。綜上所述,SM、RFP、INH高、低耐濃度基因突變率,說明了耐藥結核分枝桿菌基因突變與傳統藥物敏感試驗是有密切聯系的,且耐藥結核分枝桿菌基因突變絕大多數易發(fā)生在高濃度耐藥株中,也有少部分在低濃度耐藥株中發(fā)生突變。還有單個多耐藥株的二、三種基因同時突變的現象,且均發(fā)生在高濃度耐藥區(qū)域,故不同梯度的藥物敏感試驗是可以篩選出大量耐藥結核桿菌。若要進一步確診,可根據PCR-SSCP試驗,用上述三種耐藥基因技術