dna納米自組裝技術研究進展

dna納米自組裝技術研究進展

dna是脫氧核糖（abu）的簡稱，是一種重要的脫氧核糖聚合物。每個準分酸由三種成分組成：脫氧核糖（戊糖）、磷酸和氮堿基。不同的氨基酸堿基是堿基。有兩種堿基酪氨酸，包括5-磷酸和牛仔布（g），吡啶類包括硝基吡啶（g）和胸腺吡啶（t）。磷酸之間通過磷酸二甲酯鍵連接，即5-磷酸羥基和其他羥基羥基形成共價鍵。這兩個亞鏈可以通過堿性基對之間的氫鍵進行反向組合，形成兩個鏈對的原則。a（或t）和其他鏈（或a）的反應是兩個氫鍵。一個鏈的c（或g）和另一個鏈（或c）的反應是三個氫鍵。在大多數(shù)情況下，兩個互補的d-單鏈是右手螺旋結構中親水磷酸和糖基的骨架，以及稀疏水中的氮和堿基的兩個部分。堿基的平面與螺旋的螺旋軸垂直，螺旋旋結構寬2nm，螺距3.5m。這些性質決定了設計中最低磷酸分子的適應性，因為磷酸分子鏈之間有嚴格的堿性配合原則。在dna結構中，堿基之間的氫鍵固定在一起，并且鈉鏈之間的距離保持不變。因此，堿性組合應遵循堿性組合的原則，這意味著以堿性分子為基礎的自組裝必須嚴格可靠、易于重復。DNA納米技術最大的優(yōu)勢之一就是我們可以隨心所欲地設計結構,使得單獨的DNA序列能夠按照設計組裝形成我們想要的結構.在整體大結構設計方面,目前有3個比較常用的方法:(1)模塊結構組裝(tile).此方法的設計理念在于,將目標結構分解成更小的結構單元,利用每個結構單元里核酸鏈直接的強作用力以及結構單元之間略弱的作用力,使得整個結構得以形成.一般可以用來組裝周期性重復的結構,而且這種策略給DNA計算提供了一個非常好的平臺.在DNA折紙術出現(xiàn)之前這個方法一直是主流的自組裝方法.(2)折疊結構組裝.不同于模塊結構組裝,DNA折紙術(DNAorigami)的方法利用一條足夠長的DNA單鏈為模板,來回折疊形成一個大的模型,同時利用互補的短鏈來固定并形成特有的機構.(3)動態(tài)組裝.這個方法意在直接控制DNA自組裝的動力學,通常利用發(fā)卡結構(haripin)作為反應的出發(fā)點,不斷利用單鏈區(qū)(toehold)的鏈取代進行串聯(lián)反應并最終得到反應產(chǎn)物.這個方法的優(yōu)勢在于對納米結構的動態(tài)控制上,這也是不同于上面兩種組裝方式的一點.下面我們就這3種方法對DNA納米技術的發(fā)展和現(xiàn)狀做簡單介紹.1模塊組合的納米納米結構1.1holida交叉結DNA堿基序列的多樣性以及互補DNA序列之間的特異性結合賦予了其在生物學上的許多已知或未知的重要功能.通常情況下,DNA以線性雙螺旋結構存在,從拓撲結構看,其中心軸不存在分支.1964年,美國科學家RobinHolliday為解釋同源重組提出了著名的Holliday模型.同源重組時,兩個DNA雙螺旋同源鏈的相應位點產(chǎn)生單鏈斷裂,切口產(chǎn)生的游離末端可以移動,每條鏈都脫離其配對鏈并與另一雙螺旋中的互補鏈配對,形成一種特殊的雙螺旋交叉結構,即Holliday交叉結.Holliday模型的提出不僅推動了分子生物學的發(fā)展,同時也觸發(fā)了DNA納米技術領域的研究靈感.1983年,Seeman研究小組首次在溶液中組裝出穩(wěn)定的(不會發(fā)生與基因重組過程中類似的分支遷移現(xiàn)象)Holliday分支結構.該結構由4條短鏈DNA相互雜交形成四臂結構,每條臂上包含8個堿基對,如圖1(a)所示.他們依據(jù)DNA結構在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳淌度以及DNA熱變性所引起的紫外增色效應等,驗證了所形成的分支DNA結構.Holliday交叉結的成功設計,為組裝具有空間復雜性的DNA納米結構奠定了基礎.1.2存在于dae和dapon的雙交叉結結構DX模塊是指兩條并置的雙螺旋DNA通過兩個Holliday交叉結連接成一體的特殊DNA結構.較之普通的DNA雙螺旋,DX模塊的結構剛性大大增加,因此適合于構造具有空間復雜性的DNA納米結構.1993年,Fu和Seeman報道了關于DX模塊的設計和組裝方面的工作.他們一共設計了5種不同結構的DX模塊:DAE(反平行,結間距離為偶數(shù)個half-turn),DAO(反平行,奇數(shù)個half-turn),以及3種平行取向的DX結構DPE、DPOW和DPON.聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示:3種平行取向(DNA鏈經(jīng)過交叉結進入另一條雙螺旋后不改變其走向)的DX分子不太穩(wěn)定容易解鏈或者形成多聚體,而兩種反平行DX模塊(即DAE和DAO)則能以穩(wěn)定的雙交叉結形式存在(圖1(b)).DX模塊由兩個4臂交叉結(Holliday交叉結)構成,可以設計黏性末端實現(xiàn)不同DX模塊之間的特異性結合,進而組裝得到周期性的一維或二維DNA晶格結構.在DX模塊的基礎上,研究人員進一步設計了含有不同DNA雙螺旋數(shù)目的組裝模塊,以滿足構建更為復雜多變的DNA納米組裝結構的需要.2000年Labean等人報道了含有3個DNA雙螺旋區(qū)域的交叉結組裝模塊(圖1(c)),以該模塊作為基本單元,組裝得到周期性、結構可控的DNA二維晶體.2005年Adleman研究組設計了含有4個雙螺旋區(qū)域的組裝模塊(圖1(d)),模塊之間可通過黏性末端相互連接得到了具有較小孔洞面積和較高DNA面密度的二維平面結構.同年,Seeman研究組報道了一種含有6個DNA雙螺旋的交叉結組裝模塊,并基于合理的結構設計得到DNA納米管和二維陣列結構.1.3角形模塊對于簡單的四臂Holliday交叉結,由于每條臂均為DNA雙螺旋結構,結構剛性較弱,通常情況下并不適合用作納米結構的組裝模塊.在此基礎上,Yan等人于2003年設計了含有4個四臂交叉結的十字形組裝模塊,如圖1(e)所示.十字模塊的每條臂均由兩個DNA雙螺旋通過一個交叉結連接組成,其增強的結構剛性有利于復雜結構的設計和組裝.隨后Mao研究組對十字模塊進行了延伸,設計了剛性的三角形模塊,由3個等同的Holliday交叉結兩兩融合而成(圖1(f)).三角形的每個頂點均為四臂交叉結每個Holliday交叉結的兩條臂對應三角形的兩條邊另外兩條臂可以用來設計黏性末端.三角形的三條邊長度相等且具有較強的剛性,在此限定下,其3個內角都為60°,具有特殊的結構穩(wěn)定性.2005年,Mao研究組設計了三點星狀模塊.該模塊由3條DNA相互纏繞而成,可看作十字模塊的一個變體(圖1(g)).其中心處延伸出3個分支,每個分支由兩條DNA雙螺旋通過Holliday交叉結連接而成.通過控制3個分支在中心連接處的柔性,該模塊可被組裝成DNA平面陣列或多面體結構.該模塊的設計很好地體現(xiàn)了序列對稱性的設計思想,能夠一步、高效地形成所期望的平面或三維多面體結構.除三點星和四點星(即十字模塊)之外,五點星和六點星結構模塊也被成功用于DNA納米結構的組裝.除了在復雜性方面的嘗試以外,Mao研究組利用回文結構對DX模塊進行了對稱化的簡單處理,只利用兩條鏈就能形成二維結構,在去掉曲終的一條側鏈以后,剩下的結構依然可以自組裝,只是由于缺乏更多剛性束縛,結構變成了管狀.1.4大尺寸組合結構的生成值得一提的是,Yin等人在2008年利用兩對互補序列構成一條四區(qū)域長鏈(圖2(a)),然后把這條鏈作為一個單鏈模塊(他們稱之為single-strandedtileSST)進行自組裝,如圖2(b)示,結果顯示即使是這么簡單的單鏈模塊也能很好地形成大的結構,組裝的圖形包括了納米帶和納米管兩種,同時可以通過控制參與組裝的tile種類來控制他們的寬度,如圖2(c所示.2012年,Yin研究組發(fā)展了以SST為基礎的大平面組裝,和DNA折紙術一樣,這個方法也不需要反應物嚴格控制計量比和純度,但是作為以短鏈結構SST作為組裝基元的方法,沒有中心長鏈的支撐,也可以得到純度和效率都很高的產(chǎn)物,讓大家開始重新考慮tile組裝的原理(圖3(a)).2013年Ke等人就在這個概念的基礎上更進一步得到三維的組裝結構,如圖3(b).2基于成核鏈的非對稱結構的我國dna紙媒在tile自組裝中,多數(shù)都是通過DNA先形成一個穩(wěn)定的可編碼tile模塊,然后再進一步組裝出高級結構的,這一過程又稱為層次自組裝(hierarchicalassembly),與之相對的就是成核自組裝(nucleationassembly),即整個組裝過程中圍繞某些成核點一次進行.這一組裝其實也是tile組裝的延伸,主要是利用tile進行的算法自組裝,這部分工作的主要初衷是打算通過控制DNA分子間的生化反應來完成數(shù)學運算,它起源于1994年Adleman成功地用DNA一維自組裝解決了7頂點的漢密爾頓路徑問題.隨后LaBean的異或運算,Yan等人用拷貝運算得到的一維條形碼等,都是這些工作的延續(xù).2004年,Shih等人首次把成核鏈用于構造圖形,他們用一條DNA單鏈配合另外5條較短的互補鏈,形成了一個八面體的結構.2006年,Rothemund基于這個思想,使用一條長達7249個堿基的單鏈DNA作為骨架鏈,加上用來綁定的輔助鏈,構建了一個完整充實的二維結構.然后通過設計不同的輔助鏈,Rothemund成功地用DNA折紙術得到了方形、矩形、五角星、笑臉以及兩種不同的三角形(圖4).最初Rothemund設計的這些結構都是平面實心的對稱的圖形,后來上海交通大學和上海應用物理研究所合作用DNA折紙術做出了一個中國地圖的形狀(圖5),這是第一個非對稱性的圖形.而后沿著這個方向,三維DNA折紙術開始被研究人員所重視,2009年Andersen等人利用DNA折紙術折出了一個六面體的空心盒子;Ke等人也用類似的方法得到了一個空心四面體.兩者不同在于,前者是把六面體的每個面都單獨折疊,而后者是采用的整體化設計.同時,William小組[23~27]構造了更多的三維實心圖形,包括多面體和有孔三維結構等很多精確控制的結構,與最初的Rothemund的二維設計不同的地方在于,輔助鏈被從32個堿基降到了21個堿基,這樣就避免了每3個turn就多余0.5堿基的扭力積累,同時褶皺狀的排布還可以有效地降低核酸鏈之間的靜電斥力.2011年,Yan研究組跳開剛性點陣模型,只通過支架結構來定義目標物體的特征,通過調節(jié)DNA結構,構建連接構架非常完美地在3D表面上達到了修改細微曲率的任務.這一方法指出單純通過改變交叉連接點之間核苷酸的數(shù)目和交叉位置就能設計出不同的二維結構,同樣這樣改變也適用于平面內外曲率的結構構造中.最終他們以構建同心環(huán)結構的方式,與非B型構型DNA結合,得到了很多精巧的結構(圖6),比如球體、半球體、橢圓殼形以及納米花瓶,這次突破給DNA折紙術三維自組裝掀開了新的篇章.3動態(tài)dna納米技術動態(tài)DNA納米組裝主要是指建立具有動態(tài)功能的核苷酸體系,比如DNA計算和DNA機械運動DNA組建的納米機械裝置是指通過改變條件從而使DNA復合物的構型發(fā)生變化,是一種特殊形態(tài)的納米機器人.1999年Mao等人利用改變溶液buffe促使B-DNA和Z-DNA構型的相互改變.隨后Bernard研究組設計了一種以DNA為能量來源的分子鑷子.2002年Yan等人設計了另外一種DNA機器來界定PX構型與JX2構型之間的轉換.同時這些DNA組裝的納米器件還被賦予了運輸?shù)墓δ芡ㄟ^結構的動態(tài)開關來實現(xiàn)功能性貨物的運輸[32~34]除了構型轉換和模擬開關這兩類納米器械以外,還有一種很新穎的納米裝置就是DNAwalker,這類裝置是指DNA納米機器沿著特定的方向有序行走,其中包括很多策略.最初的設計者通過手動加入指示鏈達到使DNAwalker行走的目的,而后,Tian等人和Bath等人分別設計了通過脫氧核酶或限制性內切酶來消除walker通行的障礙,這樣DNA就可以順著預定的方向自發(fā)地移動.隨后DNAwalker的行走方向從線性方向被拓展到二維平面.需要指出的是,DNAwalker這樣的納米機械被有機合成方面的學者敏銳地利用起來作為多步化學合成的指示器,這類反應也就被稱為DNA指導的化學合成.正因為動態(tài)DNA納米技術在機械裝置方面的獨特性質,使得越來越多的研究人員開始從DNA靜態(tài)結構的自組裝方向向DNA機械組裝方向拓展,這些裝置包括電路、催化放大器、自動分子馬達和可重構納米結構.而在這些裝置里,最常用的反應模式就是鏈取代反應,圖7可以簡單說明此反應的原理和應用.鏈取代反應是指與目標序列完全或者部分互補匹配的DNA鏈,取代其中一條預雜交好的DNA鏈的過程,反應是一個競爭過程.此反應過程起始于目標結構的單鏈區(qū)(toehold),目標DNA通過分支遷移可以取代掉預雜交的一條DNA鏈.而被取代下來的DNA鏈同樣可以作為下一個鏈取代反應的啟動鏈,這樣的串聯(lián)控制就形成了一個以鏈取代反應為基礎的網(wǎng)絡結構,從而使得復雜的計算機計算和信息處理成為可能.同時,鏈取代反應可以在恒溫條件下發(fā)生.鏈取代可以用來設計能實現(xiàn)負責邏輯運算的分子邏輯門,不同于傳統(tǒng)的電子器件計算機,分子計算機使用特定的化合物的濃度作為信號的輸入輸出,在核酸的鏈取代通路里,信號可以被視作某一條參與了鏈取代反應的DNA單鏈的濃度,通過取代和被取代,這條鏈會被消耗或者釋放,從而達成輸出信號的控制.這個方法所設計的邏輯門包括與門(AND)或門(OR)和非門(NOT).在這些研究的基礎上Winfree研究組提出了以DNA構建的可以對0到15實現(xiàn)開方運算的四比特分子通路,在他們的體系里核心的序列是一條130個堿基的DNA單鏈,如圖8所示.除此之外,鏈取代也可以被用來組裝動態(tài)的納米結構.首先使用DNA分子發(fā)卡作為反應物,這樣和取代鏈反應后即使被結構打開,依然沒有從反應物中分離,DNA分子發(fā)卡中被打開的一部鏈可以作為啟動鏈繼續(xù)打開新的反應物.這個反應也可以用來構建簡單的三臂、四臂交叉結和樹枝狀大分子.DNA組裝的納米器件除了被發(fā)展成具有運輸和計算作用的機器以外,還具有智能控制納米裝置的能力,并且可以使更多的裝置表現(xiàn)出強大的功能性[45~47].例如,可以在DNAorigami模板上通過控制DNA機器的起始狀態(tài)從而完成對其運行過程的精確控制,這種可以通過設計來調控的自動移動可視為DNA納米級別的“生產(chǎn)線”;為了實現(xiàn)更多的功能化納米機器,有研究組利用設計的分子機器人(類似于DNAwalker的原理)在DNAorigami模板上實現(xiàn)“起、承、轉、?！钡裙δ?這種被稱為分子蜘蛛的機器極大地豐富了DNA納米器件的應用性,同時也向大家展示了人為設計的可控性所能實現(xiàn)的功能化作用.4納米dns技術的應用4.1動態(tài)dna納米技術以DNA自組裝圖形為模板或襯底,通過各種修飾或反應,構成小分子或顆粒的特異或非特異的納米級別精確排布有諸多優(yōu)點:能排布的對象多,包括各種生物分子與納米顆粒,原則上只要能與DNA鏈發(fā)生反應即可;DNA自組裝圖形都是納米級別分辨率,與宏觀的排布形成鮮明對比;能夠精確定位,參與自組裝的往往有多條鏈,在哪條鏈上做修飾,最終就在哪里排布;操作相對簡單,因為DNA模板是自底向上自組裝的,唯一要解決的就是排布對象與DNA的連接問題.(1)核酸.首先就是利用DNA的自組裝模板對核酸進行功能化排布.2005年Lund等人在4×4til形成的田字形網(wǎng)格上面伸出寡核苷酸鏈,采用鏈霉親和素標記的方法在AFM下觀察,平均效率達64%2008年Ke等人開發(fā)了DNA折紙芯片,通過V字形探針的設計方式,能夠在AFM下直接檢測到雜交結果,從而實現(xiàn)無標記的檢測.之后他們還專門討論了探針的位置效應.除了排布簡單的DNA探針實現(xiàn)檢測,另一個有趣而實用的方向是把DNA自組裝圖形和DNA納米器件結合起來,構造可尋址的功能性核酸鏈陣列,這部分的應用我們在對動態(tài)DNA納米技術一節(jié)里已有較為詳細的介紹.(2)蛋白質.2003年,Yan等人在發(fā)明4×4til的文章中首次報道在DNA自組裝圖形上排布了鏈霉親和素蛋白.兩年后,Park等人使用兩種tile構圖簡單地控制了鏈霉親和素的位置和距離.此后不久他又進一步做出4×4的有限網(wǎng)格,并在上面特異的地方修飾鏈霉親和素,顯示出“DNA”的字樣,充分體現(xiàn)了對蛋白位置的可控性.由于核酸適配體本身也是核酸構成的,所以連接在DNA自組裝結構中非常方便,目前一般是用它來結合蛋白.2005年,Liu等人通過在TX的莖環(huán)上連TBA,實現(xiàn)了凝血酶的一維排布.2007年,Chhabra等人把多種蛋白在同一個DNA模板上(包括DX-array和折紙術矩形)進行特異性可編碼排布.一年后,Rinker等人用同樣的方法,通過控制核酸適配體間的距離,使兩個核酸適配體結合一個蛋白(稱為多價結合,multivalentbinding),并進一步把它與單價結合的親和力進行比較.還有一種方法就是利用共價連接DNA和蛋白,并且利用DNA的雜交達到將蛋白固定在組織模板上的目的.這樣做可以有助于我們對蛋白質相互作用的認識以及酶反應動力學和機理的研究.4.2金納米顆粒的修飾修飾最常用的納米金顆粒(Aunanoparticle,AuNPornanogold)在水中形成的分散系俗稱膠體金,金顆?？膳c氨基發(fā)生非共價的靜電吸附而牢固結合,與巰基之間形成很強的Au2S共價鍵,后者也是最常用的納米金與DNA的結合方式.金納米顆粒的組裝最初是利用寡核苷酸雜交法.2004年,Seeman研究組率先用雜交法實現(xiàn)了AuNP的條紋排列.次年,他們又完成了兩種大小AuNP的有序交叉排列.這兩次都是在DX-array中排布的.Yan研究組把基底改為4×4tile的網(wǎng)格,這種圖形的好處是tile間距大且位阻效應小,實現(xiàn)了納米金的等間距排列(保證每個金球只連在一個位點上).當然,也有在金納米顆粒上直接組裝DNA的例子.2008年,Sharma等人所利用的高效組裝方法能得到90%以上的產(chǎn)率,他們把巰基修飾的DNA改為用酯化的硫辛酸修飾,從而與金的結合由一個巰基(monothiol)變?yōu)榱藘蓚€硫鍵(dithiol).Kelley研究組通過對DNA堿基骨架的巰基修飾來代替通常的末端修飾,從而使得DNA和無機納米材料的作用力更加牢固,他們使用量子點作為載體,可以形成非常規(guī)則的各種形式的復合物,而修飾組裝了DNA的量子點的光電性質可以給光學性質的檢測、太陽光儲能以及生物學性質的研究帶來更多的選擇(圖9).4.3dna八面體的組裝DNA納米技術也可以被擴展到做檢測.早在1991年,Seeman等人就利用10條DNA鏈在溶液里組裝成了一個DNA立方體;隨后還有不同策略下利用DNA組裝而成的DNA八面體.這些組裝的策略復雜,組裝的效率比較低且結構比較松軟.真正能夠用在生物傳感檢測是在2005年Go