益氣軟堅(jiān)散結(jié)法對甲狀腺功能減退大鼠心肌r1rna表達(dá)的影響

益氣軟堅(jiān)散結(jié)法對甲狀腺功能減退大鼠心肌r1rna表達(dá)的影響

減少甲狀腺功能是指由于甲狀腺激素的合成和分泌減少或組織使用不足引起的全身代謝障礙。甲減與心肌損傷密切相關(guān)。甲減心臟損害最早由Zondez于1918年報(bào)道,目前認(rèn)為70%～80%甲減患者有心血管病變,甲減致心肌損傷和心功能不全的機(jī)制復(fù)雜,但與血清T3對心臟功能的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。甲減可以減少血容量,降低心臟舒張功能,增加外周血管阻力,降低心肌收縮力,減慢心率,從而減少心輸出量,使心臟代償性增大。血清T3通過與心肌細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素核受體(TRs)結(jié)合發(fā)揮對心肌細(xì)胞的作用,TRs有3個(gè)主要亞型即TRα1,α2,β1。其中TRα1較其他亞型與T3的親和力高,而TRα1在機(jī)體內(nèi)的分布主要以心肌為主,我們前期研究發(fā)現(xiàn)單純中藥可以明顯提高甲減大鼠血清T3水平,機(jī)制不清楚,該法對甲減心肌損傷的改善是否與提高TRα1表達(dá)有關(guān)未見報(bào)告。因此,進(jìn)一步證實(shí)中醫(yī)治法對甲減致心肌損傷的修復(fù)作用及對甲減大鼠心肌TRα1mRNA表達(dá)的提高具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用低碘飼料和高氯酸鈉復(fù)制甲狀腺功能減退致臟器損傷的動(dòng)物模型,用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Elisa法)測血清TSH,放射免疫分析法(RIA)測血清TT3,TT4。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR法)檢測大鼠心肌TRα1mRNA的表達(dá)。來證實(shí)益氣軟堅(jiān)散結(jié)組能對甲狀腺功能和心肌TRα1mRNA的表達(dá)及心肌形態(tài)有恢復(fù)作用。此為中藥防治甲減心肌損傷機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1動(dòng)物分組、模型構(gòu)建甲減動(dòng)物造模方法參照Kolaja法制作,選用4周齡的Wistar大鼠(90～120g),雌雄各半,飼以實(shí)驗(yàn)專用的低碘飼料(其含碘量為20μg/kg),同時(shí)喂1%高氯酸鈉19天停用,續(xù)喂雙蒸餾水2天(計(jì)21天),隨機(jī)分4組,每組30只。正常組:普通飼料,雙蒸水。模型組:低碘飼料,雙蒸水。L-T4組:低碘飼料,每日灌服2mL的L-T4混懸液,L-T4含量約為9.45μg/kg,并灌服2mL的雙蒸水。益氣軟堅(jiān)散結(jié)組:低碘飼料,灌服2mL含生藥量約為18.9g/kg的芪貝復(fù)元飲,并灌服2mL的雙蒸水。動(dòng)物處死時(shí)間和數(shù)量:分別在給處理因素后的0天、56天處死動(dòng)物,每組每次相應(yīng)處死10只動(dòng)物。1.2烏拉坦血清學(xué)測定處死前一天,將大鼠放入代謝籠中,留24h空腹尿,取3～5mL放入5mL的eppendorf管中,保存在-20℃冰箱中。處死前,稱體重,20%烏拉坦腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,存入1.5mLeppendorf管中,保存在-20℃冰箱中。腹主動(dòng)脈采血后,迅速準(zhǔn)確取出心臟置于Trizol固定液中,-70℃冰柜保存。1.3elisa試劑盒大鼠血清促甲狀腺激素(TSH)測定用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Elisa法),美國Rapidbio(RB)公司ELISA試劑盒。血清總T3(TT3),總T4(TT4)測定用放射免疫分析法(RIA),試劑盒由北京賽博潤特科技發(fā)展中心提供。1.4尿碘測定采用中華人民共和國衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法。砷鈰催化分光光度法測定尿碘。1.5采用real-timepcr法檢測大鼠心肌tr1mna的發(fā)現(xiàn)變化1.5.1儀器、實(shí)驗(yàn)設(shè)備熒光定量PCR試劑盒,cDNA合成試劑盒(由大連寶生物提供),PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra),ABI7500擴(kuò)增儀、DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),小型臺(tái)式離心機(jī)(美國SIGMA,1-13),高速冷凍離心機(jī)sigma31k5C型(美國),紫外分光光度計(jì)(英國UV-visibleSpectrometer,UV300)。1.5.2操作步驟(1)rna的紫外分光光度計(jì)檢測取組織100mg,用TRIzol試劑(GIBCO公司)按試劑盒所述方法提取總RNA,采用紫外可見光分光光度計(jì)測定260nm、280nmOD值,樣品-70℃保存?zhèn)溆?。?μLRNA樣本,加79μLDEPC水,用紫外分光光度計(jì)測RNA濃度和純度。取2μg總RNA利用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega公司)逆轉(zhuǎn)為cDNA,-20℃保存。(2)變性20sPCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;93℃變性30s;55℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。1.5%瓊脂糖電泳鑒定PCR結(jié)果。(3)實(shí)際pcr的常數(shù)使用熒光定量PCR試劑盒由大連寶生物提供,按照試劑盒說明研究TRα1mRNA在心肌細(xì)胞上的陽性分布及定位。(4)pcr固定溶解曲線的定量測量熒光定量PCR試劑盒由大連寶生物。定量PCR程序?yàn)?5℃5min;95℃15s;63℃40s,40個(gè)循環(huán)。1.6光下心肌形態(tài)的觀察常規(guī)HE染色,光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)改變。1.7檢驗(yàn)t檢驗(yàn)?zāi)虻庵涤媚虻庵形粩?shù)表示,其余數(shù)值用(xˉ±sxˉ±s)表示。兩個(gè)樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),兩個(gè)以上樣本均數(shù)比較用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1結(jié)果分別為0天和56天見表2。2.2大鼠心臟的絕對和相對重量n.8見表3。2.3采用益氣健康散結(jié)法對減少甲大鼠的甲狀腺功能影響見表4。2.4光學(xué)顯微鏡觀察2.4.1小等效質(zhì)構(gòu)與心肌纖維(1)正常組:心肌細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核大小相等,細(xì)胞質(zhì)均勻,心肌纖維連續(xù),致密(見插圖Ⅱ圖1);(2)模型組:近80%的細(xì)胞腫脹變形,部分細(xì)胞融合成片,細(xì)胞核偏移或消失,細(xì)胞質(zhì)呈空泡樣,心肌纖維斷裂,稀疏(見插圖Ⅱ圖2)。2.4.2核酸偏移或消失L-T4組:部分細(xì)胞恢復(fù)呈橢圓形,排列稀疏,細(xì)胞核偏移或消失(見插圖Ⅱ圖3);芪貝復(fù)元飲組:細(xì)胞排列較前緊密整齊,部分細(xì)胞質(zhì)空泡樣變性消失,心肌纖維較連續(xù)(見插圖Ⅱ圖4)。2.5素描素描(1)如表5所示模型組較正常組心率減慢,電壓偏低,說明心臟每搏輸出量減少,提示心肌供血不足。(2)處理因素56天芪貝復(fù)元組與L-T4組均可以影響甲減大鼠的心功能,改善心肌供血不足的現(xiàn)象,芪貝復(fù)元組與L-T4組比較無明顯差異。2.6采用益氣健康散結(jié)法對甲狀動(dòng)脈細(xì)胞tr1nmolu的影響2.6.1tr1mna溶解曲線見插圖Ⅱ圖5。2.6.2對甲減模型大鼠心肌tr1基因表達(dá)的影響法計(jì)算每個(gè)樣本中參照基因與目的基因的CT值差異,能衡量基因表達(dá)水平,根據(jù)TRα1mRNA的溶解曲線,取最佳溶解溫度是86℃的CT值,表中示:中藥組的TRα1基因表達(dá)較西藥組高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益氣軟堅(jiān)散結(jié)法可以使甲減模型大鼠心臟組織中的TRα1基因表達(dá)增加,對心肌損傷有一定的恢復(fù)作用(見表6)。3合成酶基因trs甲減最嚴(yán)重的并發(fā)癥就是甲減性心臟病,所謂甲減性心臟病是指甲狀腺功能減退的患者伴有心肌改變或心包積液,心臟是甲狀腺激素作用的主要靶器官之一。甲減時(shí)甲狀腺激素不足,FT3、FT4水平降低直接影響心臟收縮功能和舒張功能,致心臟細(xì)胞間黏蛋白、黏多糖沉積,導(dǎo)致心肌張力減退,心肌假性肥大,心肌纖維間質(zhì)黏液性腫脹、變性、壞死,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,光學(xué)顯微鏡下可見近80%的細(xì)胞腫脹變形,部分細(xì)胞融合成片,細(xì)胞核偏移或消失,細(xì)胞質(zhì)呈空泡樣,心肌纖維斷裂,稀疏。甲減時(shí)出現(xiàn)心臟電傳導(dǎo)異常,在心電圖上的變現(xiàn)為心率減慢,肢體導(dǎo)聯(lián)低電壓等,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素對心臟的功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。但要通過與甲狀腺激素核受體結(jié)合才能發(fā)揮對心肌細(xì)胞的作用。TRs在各組織器官中廣泛分布。其中TRα1在心臟組織中表達(dá)最多,而且它與血清T3的親和力較其他受體異構(gòu)體強(qiáng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于甲狀腺功能減退癥的治療主要是依靠甲狀腺激素的替代治療,往往不能達(dá)到治愈的效果,還易誘發(fā)心肌缺氧導(dǎo)致心絞痛甚至心梗的發(fā)生,所以其不良反應(yīng)不容忽視。中醫(yī)對甲減治療和研究由來已久,中醫(yī)學(xué)雖無“甲狀腺功能減退”之病名,但根據(jù)其臨床癥狀和體征,一般歸屬“虛勞”范疇。導(dǎo)師經(jīng)多年臨床研究發(fā)現(xiàn)脾氣虛弱也是甲減的主要證型?！蹲C治匯補(bǔ)·虛損》亦指出“虛者,血?dú)庵仗撘?損者,臟腑之損壞也”。說明重視“后天之本”的重要性。導(dǎo)師