蛋白激酶A參與抗膽堿藥物快速抗抑郁作用機(jī)制研究

蛋白激酶A參與抗膽堿藥物快速抗抑郁作用機(jī)制研究研究背景:抑郁癥嚴(yán)影響著著人類的健康,并給公共衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。目前抑郁癥的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確,治療現(xiàn)狀并不理想。當(dāng)前臨床經(jīng)典抗抑郁藥多針對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控來發(fā)揮作用。這類藥物普遍起效緩慢,往往需要數(shù)周乃至數(shù)月才見效,且療效不佳,并可能增加患者自殺、致殘的風(fēng)險(xiǎn)。因此,開發(fā)新型快速的抗抑郁藥物具有著十分重要的臨床和社會(huì)意義。近年來,研究發(fā)現(xiàn),在亞臨床劑量下,非選擇性M型膽堿能受體阻斷劑東莨菪堿具有快速而顯著的抗抑郁作用,但其具體作用機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),與其他具有快速抗抑郁作用的藥物類似,東莨菪堿通過增強(qiáng)AMPA受體功能,一過性地激活mTOR通路,進(jìn)而重塑慢性應(yīng)激導(dǎo)致的突觸傳遞障礙。然而東莨菪堿究竟通過何種機(jī)制增強(qiáng)AMPA受體的功能,以及自阻斷M受體到激活mTOR信號(hào)通路之間的胞內(nèi)事件尚不明確。對這個(gè)問題的研究和闡明,將有助于揭示抗膽堿類藥物快速抗抑郁的作用機(jī)制,并為開發(fā)新型快速安全的抗抑郁藥物奠定理論基礎(chǔ)。目的:本研究通過電生理技術(shù),腦立體定位手術(shù),急性海馬腦片孵育,細(xì)胞膜蛋白提取,Westernblot,習(xí)得性無助(Learnedhelplessness,LH)抑郁模型以及抑郁樣表現(xiàn)的行為學(xué)檢測等方法,探討蛋白激酶A參與東莨菪堿對AMPA受體的增強(qiáng)以及激活mTOR通路的上游機(jī)制,并比較東莨菪堿與其他特異性M受體阻斷劑的作用效果,為揭示快速抗抑郁藥物作用機(jī)制和開發(fā)新型快速安全的抗抑郁藥物提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、采用大鼠習(xí)得性無助(learnedhelplessness,LH)應(yīng)激方法建立抑郁模型,并通過相關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(強(qiáng)迫游泳,開放曠場,糖水偏愛)檢測造模效度。2、分別用0,10nM,100nM,1μM,10μM濃度東莨菪堿溶液灌流應(yīng)激后大鼠腦片,檢測東莨菪堿促進(jìn)GluA1Ser845及mTORSer2448位點(diǎn)的磷酸化水平的作用與其濃度的關(guān)系。3、利用電生理技術(shù),在NMDA受體的阻斷劑APV孵育并灌流海馬腦片的基礎(chǔ)上,給予東莨菪堿(1μM)灌流,記錄CA1輻射區(qū)興奮性突觸后場電位(SC-CA1fEPSP)的變化,并以PKA的選擇性的阻斷劑H89(1μM)預(yù)孵育并灌流腦片,觀察其對東莨菪堿這一作用的影響。4、急性分離的海馬腦片予以東莨菪堿或合并H89進(jìn)行孵育,用細(xì)胞膜蛋白提取技術(shù)分離膜蛋白進(jìn)行Westernblot檢測,研究東莨菪堿及H89對GluA1和GluA2膜表達(dá)水平的影響。5、在經(jīng)過GABAa受體阻斷劑picrotoxin(100μM)預(yù)處理的海馬腦片上,再給予東莨菪孵育,觀察CA1區(qū)GluA1Ser845和mTORSer2448的磷酸化和GluA1表達(dá)的增加作用是否被GABAa阻斷劑所完全掩蓋。6、通過立體定位置管手術(shù),習(xí)得性無助大鼠側(cè)腦室提前注射H89或人工腦脊液,然后腹腔注射東莨菪堿,或側(cè)腦室注射M2受體選擇性阻斷劑美索拉明,取海馬CA1區(qū)進(jìn)行westernblotting檢測,觀察東莨菪堿活體給藥對GluA1總蛋白,以及GluA1Ser845和mTORSer2448磷酸化水平的作用,以及H89預(yù)處理對該作用的影響。7、同上,側(cè)腦室提前注射H89或人工腦脊液,再注射M2受體選擇性阻斷劑美索拉明,進(jìn)行westernblotting檢測,觀察其對海馬GluA1總蛋白,以及GluA1Ser845和mTORSer2448磷酸化水平的作用,以及H89預(yù)處理對該作用的影響。8、習(xí)得性無助大鼠側(cè)腦室提前注射H89或人工腦脊液,隨后給予東莨菪堿和美索拉明,進(jìn)行強(qiáng)迫游泳和開放曠場檢測,驗(yàn)證其活體條件下對抑郁樣行為的作用,以及該效應(yīng)是否受H89影響。結(jié)果:1、通過不可逃避足底點(diǎn)擊應(yīng)激,成功構(gòu)建了SD大鼠習(xí)得性無助模型。2、急性海馬腦片上,東莨菪堿劑量依賴地增加海馬CA1區(qū)GluA1Ser845的磷酸化和GluA1總蛋白的表達(dá)。東莨菪堿在1μM的濃度下增加mTORSer2448的磷酸化;在其他濃度則未見明顯激活。3、東莨菪堿在APV(100μM)孵育和灌流下,依然能夠快速增加海馬SC-CA1興奮性突觸后場電位的幅度。這一效應(yīng)可被蛋白激酶A的特異性拮抗H89阻斷。4、東莨菪堿可以快速增加海馬腦片CA1區(qū)胞膜GluA1表達(dá),該作用可以被H89所阻斷。GluA2膜表達(dá)則未受東莨菪堿和H89明顯影響。5、GABAa阻斷劑不能掩蓋東莨菪堿介導(dǎo)的GluA1Ser845和mTORSer2448位點(diǎn)的磷酸化增加。但經(jīng)過GABAa阻斷劑預(yù)處理的腦片上,未能觀察到東莨菪堿進(jìn)一步增加GluA1總蛋白的水平。6、LH大鼠腹腔注射東莨菪堿可以增加海馬GluA1總蛋白水平;這一效應(yīng)不依賴于PKA。同時(shí),東莨菪堿促進(jìn)GluA1Ser845和mTORSer2448位點(diǎn)的磷酸化。該效應(yīng)需要PKA途徑參與。7、LH大鼠側(cè)腦室注射美索拉明可以同時(shí)增加海馬GluA1Ser845和mTORSer2448位點(diǎn)的磷酸化。該效應(yīng)需要PKA途徑參與。但經(jīng)美索拉明和H89急性給藥后,未觀察到GluA1總蛋白水平發(fā)生明顯變化。8、LH大鼠腹腔注射東莨菪堿或側(cè)腦室注射美索拉明都可以縮短強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間,而不影響曠場試驗(yàn)中的自主活動(dòng)能力。結(jié)論:1、PKA對于在東莨菪堿激活A(yù)MPA受體和mTOR通路,及發(fā)揮快速抗抑郁作用是必須的,其可能是通過磷酸化GluA1Ser845,促進(jìn)AMPA受體上膜實(shí)現(xiàn)上述作用。2、東莨菪堿介導(dǎo)的GluA1總蛋白快速表達(dá)增加不依賴PKA,但受GABAa受體調(diào)控。3、選擇性M2受體阻斷劑美索拉明可以起到類似于東莨菪堿對于GluA1和mTOR的磷酸化作