柴胡種子DNA分子鑒定規(guī)程

1柴胡種子DNA分子鑒定規(guī)程本文件規(guī)定了柴胡種子DNA分子鑒定的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)原理方法和操作規(guī)程。本文件適用鑒定中藥材南、北柴胡種子的真實(shí)性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1實(shí)時(shí)熒光PCRReal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過程。3.2Ct值Cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4原理基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系，采用DNA條形碼中的ITS基因序列為靶基因，設(shè)計(jì)柴胡的通用引物與探針以及南柴胡和北柴胡的特異性引物和探針，通過對(duì)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化篩選，建立了多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，在同一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系中可以同時(shí)鑒別南、北柴胡種子的源性成分。5儀器設(shè)備及試劑25.1儀器設(shè)備儀器設(shè)備見附錄表A.1。5.2試劑5.2.1試劑見附錄B.1。5.2.2試劑的配制方法見附錄B.2。5.2.3除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。6檢測引物和探針引物序列和探針，見表1表1引物和探針序列JOE-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAGFAM-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAACROX-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGT7DNA提取每份材料混合取0.3g（大約200粒），用滅菌后的研缽在液氮狀態(tài)下研磨成粉末。將含有2%β-巰基乙醇的CTAB提取緩沖液置于65℃水浴鍋中預(yù)熱；將研磨好的樣品取0.15g置于2.0mL的離心管中；加入700μL65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃保溫30min，期間搖動(dòng)3-4次；加入700μL氯仿/異戊醇（24:1），輕輕顛倒使其充分混勻，12000r/min離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中；將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，將其充分混勻，置于-20℃30棄掉上清液，此步驟重復(fù)一遍；室溫下或超凈工作臺(tái)中自然風(fēng)干DNA（不可太干）5-10min；加入50μL3的雙蒸水或TE緩沖液，渦旋振蕩充分混勻，12000r/min離心2min，4℃保存?zhèn)溆没蛑糜?20℃保存。也可用相關(guān)植物提取試劑盒進(jìn)行柴胡種子DNA的提取。8核酸濃度及純度測定用Nanodrop紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行核酸濃度與純度檢測，OD260nm和OD280nm處測定其吸光值，OD260/280比值在1.7～1.9，說明提取種子DNA純度為佳。DNA濃度控制在0.1～50ng/μL之間，可作相應(yīng)稀釋以調(diào)整其濃度。注：用于PCR反應(yīng)的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.5，如低于1.5則重新進(jìn)行DNA的提取。9實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增9.1反應(yīng)體系按照表2依次加入試劑，配制PCR反應(yīng)體系，混勻離心分裝至PCR反應(yīng)管中，加入基因組DNA模板，8000r/min離心1min，取出PCR管放入熒光定量PCR儀中。每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系加量(μL）111BCP（FAM0.4μmol/L）1BSP（JOE5μmol/L）1BUP（ROX1μmol/L）129.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序95℃1min；45個(gè)循環(huán)，95℃5s，60℃35s，在此收集熒光信號(hào)，以上參數(shù)可根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀作調(diào)整。10結(jié)果分析與判定410.1PCR的有效性判定在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，設(shè)置如下陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照?！幮詫?duì)照：以三島柴胡作為陰性對(duì)照。PCR體系對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔均無FAM、JOX，相應(yīng)Ct值>40.0，有通用探針ROX的熒光信號(hào)，且Ct值≤35.0說明PCR體系有效性。——空白對(duì)照：以水作為陰性對(duì)照。PCR體系對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔均無FAM、JOX、ROX，說明PCR體系有效性?！栃詫?duì)照：以南柴胡/北柴胡DNA（50ng/μL）作為陽性對(duì)照。PCR體系對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中均有FAM、ROX、JOX，且Ct值≤35.0說明PCR體系有效性。注：每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置3次平行。10.2DNA提取有效性判定在同時(shí)進(jìn)行的空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常的情況下，被檢測樣品應(yīng)有相應(yīng)熒光信號(hào)檢出，且相應(yīng)熒光通道出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，滿足Ct值≤35。10.3樣品檢測結(jié)果分析和判定在符合10.2的情況下，使用PCR反應(yīng)體系對(duì)南、北柴胡種子源性成分鑒定：——當(dāng)羧基熒光素FAM和羅丹染料ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct值≤35說明檢出北柴胡種子源性成分；當(dāng)JOE、ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct值≤35說明檢出南柴胡種子源性成分?！?dāng)只有ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct≤35說明待檢樣本為偽品柴胡種子；如Ct值>40.0，則判定為未檢出相應(yīng)的源性成分；——如35.0<Ct值≤40.0，則需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，再次擴(kuò)增后的Ct值仍<40，且陰性對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果正常，則判定該樣品檢出南柴胡或北柴胡種子源性成分；再次擴(kuò)增后Ct值≥40，且陰性對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果正常，則判定該樣品未檢出南柴胡或北柴胡種子源性成分。11檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008規(guī)定執(zhí)行。（規(guī)范性附錄）儀器設(shè)備儀器設(shè)備，見表A.1。表A.1儀器設(shè)備123電子天平4臺(tái)式離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速12000r/min5高壓滅菌鍋6pH計(jì)7磁力攪拌器6（規(guī)范性附錄）試劑及試劑的配置試劑見表B.1。試劑的配置見表B.2。表B.1試劑123456789表B.2試劑的配置123稱取40g氫氧化鈉（NaOH）溶于80mL的雙蒸水40.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）溶液 7表B.2（續(xù)）5610%十六烷基三甲基溴化銨溶液稱取十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）10g，溶解于80mL雙蒸水，加熱加速溶解，雙蒸水定容至100mL，室溫保存。7CTAB提取緩沖液取10%CTAB溶液30mL（4.2.7），1mol/LTris-HCl溶液（PH8.0）10mL（4.2.30.5mol/LEDTA（PH8.0）4mL（