大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告-xiang

E.coligrowthcurvemeasurement一、目的1、瞭解細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)特徵，測(cè)定細(xì)菌繁殖的代時(shí)；2、學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配製以及接種方法；3、反復(fù)練習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)；4、瞭解不同細(xì)菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度的不同；5、掌握利用細(xì)菌懸液混濁度間接測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)的方法6、複習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法7、學(xué)習(xí)平板塗布技術(shù)二、原理1、大腸桿菌生長(zhǎng)：將一定量的細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)，可觀(guān)察到細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖有一定的規(guī)律性，如以細(xì)菌的活菌數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，可繪成一條曲線(xiàn)，成為生長(zhǎng)曲線(xiàn)（如圖一）。圖一微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)示意圖單細(xì)胞微生物的發(fā)酵具有四個(gè)階段，即Ⅰ調(diào)整期（延滯期）、Ⅱ?qū)?shù)期（生長(zhǎng)旺盛期）、Ⅲ平衡期（穩(wěn)定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。生長(zhǎng)曲線(xiàn)可表示細(xì)菌從開(kāi)始生長(zhǎng)到死亡的全過(guò)程的動(dòng)態(tài)。不同的微生物有不同的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)也不一樣。因此，測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)於瞭解和掌握微生物的生長(zhǎng)規(guī)律是很有幫助的。測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的方法很多，有血球計(jì)數(shù)板法、平板菌落計(jì)數(shù)法、稱(chēng)重法和比濁法等。本實(shí)驗(yàn)採(cǎi)用比濁法測(cè)定，由於細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度。將所測(cè)得的光密度值（OD600）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。注意，由於光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測(cè)定的生長(zhǎng)曲線(xiàn)的衰亡期不明顯。2、平板塗布技術(shù)：塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長(zhǎng)形成菌苔的特點(diǎn)用於檢測(cè)化學(xué)因素對(duì)微生物的抑殺效應(yīng)。原理:將一定濃度，一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長(zhǎng)出單菌落或菌苔而達(dá)到分離或計(jì)數(shù)的目的。其目的:用於目的微生物的分離；用於藥物的抑菌試驗(yàn)；觀(guān)察菌苔的形狀和特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀(guān)察菌落特徵，還可以進(jìn)行菌種的分離。缺點(diǎn)：接種前需梯度稀釋?zhuān)樟枯^少，較麻煩，平板不乾燥效果不好，容易蔓延。三、材料、藥品1、實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)菌（E.coli）2、培養(yǎng)基：LB

medium；

3、實(shí)驗(yàn)儀器：光電比色計(jì)、L型玻棒、接種環(huán)、超淨(jìng)工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱；四、步驟1、取100μLE.coli放入含有200mLLBliquidmedium的錐形瓶中，並搖晃均勻。2、取mixed的菌液1mL到cuvette內(nèi)，拿去測(cè)量吸光值，並記錄測(cè)得的數(shù)值。3、取500μL的菌液放入LBsolidmedium內(nèi)，並用玻璃棒塗抹均勻，放入37℃,150rpm的incubator內(nèi)培養(yǎng)。4、整個(gè)實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行24個(gè)小時(shí)又50分鐘，第三個(gè)小時(shí)開(kāi)始用n=600nm測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液吸光度，以後每隔一小時(shí)測(cè)一次，知道實(shí)驗(yàn)結(jié)束。（若吸光值大於0.7，則代表菌液的濃度太濃，需要加以稀釋。）5、除第二盤(pán)plate相距第一盤(pán)plate1小時(shí)和第三盤(pán)plate相距第二盤(pán)plate3小時(shí)之外，之後每相隔5小時(shí)就要再新畫(huà)一盤(pán)新的plate。（第一、二盤(pán)plate沒(méi)有稀釋?zhuān)谌P(pán)plate稀釋1000X，第四、五、六盤(pán)稀釋106X）五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間Time(minutes)A600Log10A600Log2A600菌落數(shù)（個(gè)/0.1mL）17:20019:101100.019-1.7212464-5.717856888020:151750.018-1.7447275-5.795859349421:122320.021-1.6777807-5.573466922:102900.025-1.60206-5.321928123:173570.023-1.6382722-5.44222234680:134130.029-1.537602-5.10780331:054650.044-1.3565473-4.50635272:075270.084-1.0757207-3.5734669圖六Log2A600在logarithmicphase中與時(shí)間的關(guān)係由圖六可以看出E.coli在logarithmicphase中以0.0136Log2A600/min的數(shù)率進(jìn)行快速增殖，Rsquare為0.9945，說(shuō)明瞭此曲綫的回歸擬合度非常高，置信度很高。3、886-1490min可以看做是本菌生長(zhǎng)曲綫的stationaryphase。因?yàn)檫M(jìn)入此期後，菌的數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，甚至停止，這是因?yàn)橛伸杜囵B(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物積聚，該期細(xì)菌繁殖速度漸減，死亡數(shù)緩慢增加，生長(zhǎng)分裂和死亡的菌細(xì)胞數(shù)處?kù)镀胶鉅顟B(tài)。該期細(xì)菌形態(tài)、染色性和生理性狀常有改變。一些細(xì)菌的芽胞、外毒素和抗生素等代謝產(chǎn)物大多在最大穩(wěn)定期產(chǎn)生。但是在圖五中看來(lái)，curve有緩緩上揚(yáng)的趨勢(shì)，分析原因可能如下：=1\*GB3①其為兼性耗氧菌，因?yàn)槊看芜M(jìn)行取菌操作的時(shí)候，都會(huì)有新鮮的空氣進(jìn)入培養(yǎng)瓶中，使氧氣得以補(bǔ)充，使其生長(zhǎng)環(huán)境得以改善，使其數(shù)量繼續(xù)增加=2\*GB3②取菌操作的時(shí)候未充分搖勻，取到了菌比較多的溶液部份。4、本次的生長(zhǎng)曲綫沒(méi)有出現(xiàn)deathphase。Deathphase是由於在後stationaryphase繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過(guò)新生數(shù)，總活菌數(shù)明顯下降，稱(chēng)為衰亡期。在這個(gè)階段細(xì)菌常出現(xiàn)多形態(tài)，包括畸形或衰退型，細(xì)胞死亡伴隨著自溶?？赡苁怯伸镀渖L(zhǎng)環(huán)境還沒(méi)有足夠惡化，使它的stationaryphase結(jié)束，應(yīng)該要再進(jìn)行一段時(shí)間的培養(yǎng)，才能到達(dá)這個(gè)時(shí)期。5、對(duì)於平板塗布的菌落計(jì)數(shù)，最後兩盤(pán)的plate可能是由於菌落數(shù)過(guò)多，稀釋的倍率不夠，導(dǎo)致經(jīng)過(guò)培養(yǎng)後無(wú)法計(jì)數(shù)的情況，也可能是由於塗布時(shí)，未將菌液足夠擴(kuò)散和乾燥，導(dǎo)致其生長(zhǎng)粘連在一起，無(wú)法計(jì)數(shù)。並且，第一盤(pán)plate菌數(shù)居然比後面2、3、4次都菌落數(shù)多，這是不符合時(shí)間吸光度測(cè)定法數(shù)據(jù)和理論依據(jù)的，可能是操作的同學(xué)沒(méi)有將菌液搖晃到足夠的均勻，導(dǎo)致取出的菌液不具有足夠的代表性。所以這次plate的數(shù)據(jù)僅能作為參考使用。七、實(shí)驗(yàn)小結(jié)這是一個(gè)大組合作、小組分工的實(shí)驗(yàn)，每一組的結(jié)果都影響了整個(gè)大組隊(duì)結(jié)果的分析，這就要求我們的合作。由於時(shí)間漫長(zhǎng)以及其他因素的綜合影響，使得到的信息量包含了這種各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也加入自己的分析?？偟膩?lái)說(shuō)，這是個(gè)很有意思也很有意義的實(shí)驗(yàn)，可