轉(zhuǎn)錄因子Pho4參與白念珠菌藥物敏感性的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子Pho4參與白念珠菌藥物敏感性的調(diào)控秦玉璘;許洪濤;張璐璐;張金宇;姜遠(yuǎn)英;曹永兵【摘要】目的通過(guò)對(duì)缺失相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因的白念珠菌進(jìn)行抗真菌藥物敏感性的篩選,考察轉(zhuǎn)錄因子對(duì)白念珠菌耐藥性的影響及調(diào)控機(jī)制.方法通過(guò)微量液基稀釋法點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)(SpotAssay)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗真菌藥物的敏感性?采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)的方法檢測(cè)白念珠菌耐藥性相關(guān)MDR1,CDR1以及ERG11的表達(dá)，并通過(guò)檢測(cè)菌株對(duì)羅丹明6G的外排能力進(jìn)一步檢測(cè)菌株對(duì)抗真菌藥物的外排能力?結(jié)果最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)測(cè)定和SpotAssay實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與親本菌相比,PHO4基因缺失菌對(duì)氟康唑、咪康唑的敏感性顯著升高.雖然耐藥相關(guān)基因的表達(dá)增加，但對(duì)羅丹明6G的外排能力降低，抗氧化應(yīng)激能力下降結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子Pho4的缺失可能通過(guò)降低白念珠菌的抗氧化應(yīng)激能力，減弱對(duì)藥物的外排作用而導(dǎo)致對(duì)唑類藥物敏感，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究.期刊名稱】《中國(guó)真菌學(xué)雜志》年(卷),期】2016(011)002【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P65-69)【關(guān)鍵詞】白念珠菌;轉(zhuǎn)錄因子;藥物敏感性;藥物外排【作者】秦玉璘;許洪濤;張璐璐;張金宇;姜遠(yuǎn)英;曹永兵【作者單位】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433;中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433;中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433;中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433;中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433;中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心,上海200433【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】R379.4白念珠菌作為一種條件致病真菌，在正常人體內(nèi)可以長(zhǎng)期、無(wú)害地共生，并與其他菌群保持平衡，機(jī)體自身的免疫力足以抵御白念珠菌的侵襲。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，對(duì)白念珠菌的抵抗能力隨之下降，引發(fā)從皮膚黏膜表層到危及生命的系統(tǒng)性真菌感染。近年來(lái)，隨著癌癥放化療增加，獲得性免疫缺陷綜合征患者不斷增多，器官移植及外植性器械的廣泛應(yīng)用使得免疫缺陷患者劇增，白念珠菌的感染率和死亡率不斷升高。臨床上用于治療念珠菌病的抗真菌藥物種類有限，其中氟康唑由于具有較高的生物利用度和較低的毒性，在臨床應(yīng)用最為廣泛。然而，在長(zhǎng)期的臨床治療中，白念珠菌逐漸對(duì)氟康唑產(chǎn)生耐藥性，大大降低了臨床治療的效果[1]。目前，在抗真菌藥物的研究中，探索真菌耐藥的機(jī)制對(duì)解決真菌耐藥問(wèn)題、發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物的新靶點(diǎn)具有重要意義。白念珠菌在長(zhǎng)期的演變中，逐步形成了多種唑類藥物耐藥機(jī)制，包括：①藥物作用靶酶突變，降低了對(duì)藥物的親和力，例如，編碼羊毛甾醇14a-去甲基化酶的基因ERG11的表達(dá)量增加使真菌細(xì)胞生長(zhǎng)不受抑制。②藥物外排泵的過(guò)表達(dá)，包括易化擴(kuò)散載體超家族(majorfacilitatorsuperfamily，MFS)及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-bindingcassettetransporters)兩大類[2]。③白念珠菌生物被膜的形成。④應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)耐藥基因表達(dá)。⑤轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控耐藥基因的表達(dá)。隨著基因水平研究的深入發(fā)展，臨床上在對(duì)氟康唑耐受的菌株中發(fā)現(xiàn)普遍鋅簇轉(zhuǎn)錄因子突變的現(xiàn)象，這些轉(zhuǎn)錄因子包括：Mrr1[3],Tac1[3-4],Upc2[5]。除鋅簇轉(zhuǎn)錄因子外，有研究顯示白念珠菌堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子Cap1通過(guò)激活耐藥基因MDR1使白念珠菌出現(xiàn)耐藥表型［6］。轉(zhuǎn)錄因子Ndt80通過(guò)控制藥物外排泵CDR1的表達(dá)來(lái)調(diào)控白念珠菌對(duì)唑類藥物的耐受性［7］。轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控白念珠菌耐藥性的相關(guān)研究對(duì)于從基因調(diào)控方面探索白念珠菌耐藥機(jī)制具有重要意義，為解決真菌耐藥問(wèn)題提供了新思路。本文通過(guò)篩選16株白念珠菌不同轉(zhuǎn)錄因子缺失菌，研究可能影響白念珠菌耐藥性的轉(zhuǎn)錄因子及未知的調(diào)控通路。材料菌株白念珠菌(Candidaalbicans)國(guó)際通用菌株ATCCMYA-2876(SC5314)由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,GeorgetownUniversity,Washington,U.S.A.)WilliamA.Fonzi教授惠贈(zèng)。SN250及16株白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子敲除菌由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院巴斯德所陳昌斌教授惠贈(zèng)，菌株列表及敲除的轉(zhuǎn)錄因子見(jiàn)表1。主要試劑氟康唑注射液(Fluconazole,FLC)購(gòu)自Pfizer，咪康唑(Miconazole,MCZ)購(gòu)自Sigma;真菌RNAout試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司,PrimeScriptTMRTMasterMix,2xSYBRPremixExTaq均購(gòu)自Takara;羅丹明6G(Rhodamine6G)購(gòu)自生工生物；藥物母液配置：氟康唑?yàn)樽⑸鋭?，濃度?mg/mL，直接取用；咪康唑使用二甲亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO)溶解，配置成6.4mg/mL儲(chǔ)備液，分裝后于-20工長(zhǎng)期貯存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)液：RPMI1640(GibcoBRL公司)10g,NaHCO32g,嗎啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,MOPS,Sigma)34.5g，加三蒸水900mL溶解，用1mol/LNaOH凋pH至7.0,定容至1000mL，過(guò)濾除菌，4工保存。YPD培養(yǎng)液(固體和液體)：蛋白胨20g，酵母浸膏10g，葡萄糖200g，加三蒸水定容至1000mL,固體加2%瓊脂，高壓滅菌后于4°C保存?zhèn)溆?。儀器7500型熒光定量PCR儀(ABI),MultiskanMK3型酶標(biāo)儀(ThermoScientific),HZ-2111K-B型恒溫振蕩器(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),HeraeusFresco21微量離心機(jī)(ThermoScientific)。方法抗白念珠菌藥物體外抑菌活性測(cè)定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的M27-A方案。采用微量液基稀釋法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株的MIC80，取96孔板，將FLC注射液用RPMI1640液體培養(yǎng)基倍比稀釋，藥物作用的最高濃度為64pg/mL,最低濃度為0.125pg/mL,每孔體積為100pL,100pLRPMI1640液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,100pL菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，藥物作用的菌液濃度為1x103-5x103cells/mL。35°C孵育24h,48h測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MIC80為與陽(yáng)性對(duì)照孔相比,菌株生長(zhǎng)80%被抑制時(shí)對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度。實(shí)驗(yàn)平行操作2-3次。SpotAssay實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物體外抑菌活性配制含藥的YPD平板，氟康唑濃度為16pg/mL、8pg/mL和4pg/mL,咪康唑濃度為8pg/mL、4pg/mL和2pg/mL。挑取單克隆菌落于1mLYPD液體培養(yǎng)基，在30C培養(yǎng)箱，200r/min振蕩培養(yǎng)，活化16h。YPD調(diào)整菌液濃度為2x106cells/mL、2x105cells/mL、2x104cells/mL、2x103cells/mL和2x102cells/mL5個(gè)濃度梯度，每種菌株，每個(gè)濃度梯度取5pL點(diǎn)板。羅丹明6G檢測(cè)藥物外排于1mLYPD液體培養(yǎng)基,30C,200r/min振蕩活化菌株使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3000g離心5min,用PBS洗3次后重懸,30C,200r/min振蕩培養(yǎng)2h，使細(xì)胞內(nèi)的能量被耗盡。10pmol/L羅丹明6G30C,200r/min孵育細(xì)胞，1h。用PBS洗去胞外的羅丹明6G,并調(diào)整菌濃度為5x107cells/mL,加入葡萄糖使終濃度達(dá)到2mmol/L，分別在15min,30min,45min,60min,90min取1mL菌液，離心，取上清100pL,測(cè)定熒光強(qiáng)度。RT-PCR考察耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平使用真菌RNAout試劑盒抽提菌株RNA并測(cè)定濃度和純度后按照TakaraPrimeScriptTMRTMasterMix試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：37工15min;85°C5s;4X：冷卻。實(shí)時(shí)定量RealTimeRT-PCR按SYBRPremixExTaqRR420A說(shuō)明書中的體系(20pL)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性98C30s;PCR反應(yīng)95C5s,60C34s,40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析95C30s;60C1min;95C15s。實(shí)驗(yàn)中使用的引物見(jiàn)表1。使用ABI7500SDS軟件系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相應(yīng)基因的Ct(thresholdcycle)值。以actin作為內(nèi)參，并以其Ct值校正目的基因的Ct值，得到ACt值。用Ratio值(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比)表示基因表達(dá)差異，Ratio值=2(-AACt)。生長(zhǎng)曲線于1mLYPD液體培養(yǎng)基,30C,200r/min振蕩活化菌株使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。適當(dāng)稀釋菌液，以YPD培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度，使OD630值為0.1。于5mL上述菌液中加入H2O2，使其終濃度為16pg/mL°30C,200r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、&10、12和24h取樣100pL,測(cè)定OD630值，以O(shè)D630值記錄菌株生長(zhǎng)變化情況。統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPadPrism5軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)通過(guò)微量液基稀釋法初步檢測(cè)16株轉(zhuǎn)錄因子缺失菌對(duì)臨床常用抗真菌藥物氟康唑的敏感性。PHO4缺失菌在表2中用編號(hào)CC007表示，初步的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHO4缺失菌與親本菌SN250相比，對(duì)氟康唑的敏感性顯著升高，24h測(cè)得MIC80為0.25pg/mL,48h時(shí)測(cè)得MIC80為0.5pg/mL。其余15株轉(zhuǎn)錄因子基因敲除菌的氟康唑藥敏篩選結(jié)果列在表3中。SpotAssay實(shí)驗(yàn)點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)考察PHO4基因缺失菌對(duì)氟康唑和咪康唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)在YPD固體培養(yǎng)基上，pho4-/-對(duì)氟康唑和咪康唑均敏感，隨著氟康唑的濃度增加，敏感性增加，對(duì)16pg/mL的氟康唑最敏感。然而，pho4-/-對(duì)咪康唑的敏感性明顯高于氟康唑，4pg/mL和8pg/mL咪康唑?qū)ho4-/-均有明顯的抑制作用（見(jiàn)圖1）。2.3羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)加入葡萄糖供能后60min，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，親本菌和突變株對(duì)羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)增加。從加入葡萄糖15min開(kāi)始到90min,PH04敲除菌對(duì)羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)能力低于親本菌SN250,PH04敲除菌中藥物外排泵活性低于SN250（見(jiàn)圖2）。2.4親本菌SN250和PH04敲除菌中耐藥相關(guān)基因的表達(dá)水平RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PH04缺失菌中多藥耐藥基因MDR1,CDR1的轉(zhuǎn)錄水平均高于親本菌SN250。唑類藥物的作用靶酶羊毛甾醇14a-去甲基化酶的編碼基因ERG11在親本菌SN250及突變株中的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖3）。2.5H2O2對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)表明，16pg/mLH2O2對(duì)PH04基因缺失菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，PH04基因的缺失降低了白念珠菌對(duì)H202的耐受能力（見(jiàn)圖4）。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象日漸嚴(yán)重。白念珠菌產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的原因復(fù)雜，耐藥機(jī)制與多種因素有關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子參與耐藥相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控逐漸深入，從分子水平給出了解決真菌耐藥問(wèn)題的新途徑。轉(zhuǎn)錄因子Pho4對(duì)白念珠菌在缺乏磷酸鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)是必須的，PH04突變株在磷酸鹽缺乏的條件下發(fā)生廣泛的菌絲生長(zhǎng)和顯著的毒力增加［8］。另有研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子Pho4介導(dǎo)菌株對(duì)亞砷酸鹽的反應(yīng)，但并未有該轉(zhuǎn)錄因子參與耐藥相關(guān)調(diào)節(jié)的報(bào)道。本研究應(yīng)用經(jīng)典的微量液基稀釋法對(duì)16株轉(zhuǎn)錄因子基因缺失菌的藥物敏感性進(jìn)行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)PH04基因缺失菌對(duì)氟康唑的敏感性有明顯升高，揭示其可能參與了白念珠菌耐藥性的調(diào)控。Spotassay實(shí)驗(yàn)在固體YPD培養(yǎng)基中檢測(cè)突變株對(duì)氟康唑，咪康唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)缺失PHO4的白念珠菌對(duì)咪康唑的敏感性高于氟康唑。氟康唑和咪康唑作為臨床常用的抗白念珠菌感染藥物，均通過(guò)影響真菌細(xì)胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成，即抑制ERG11編碼的羊毛甾醇14a-去甲基化酶發(fā)揮藥理作用。為進(jìn)一步探究PH04參與調(diào)控耐藥的分子機(jī)制，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察了ERG11的轉(zhuǎn)錄水平，并未發(fā)現(xiàn)PHO4缺失后顯著影響ERG11的表達(dá)。而羅丹明外排實(shí)驗(yàn)顯示，與親本菌SN250相比，PHO4缺失菌對(duì)羅丹明6G的外排能力減弱，與其對(duì)唑類藥物的敏感性增加結(jié)果一致，但PHO4缺失菌中MDR1和CDR1的轉(zhuǎn)錄水平反而有增加。為什么多藥耐藥基因表達(dá)增加，但藥物外排能力卻下降？為進(jìn)一步探索其機(jī)制，本研究進(jìn)一步考察了缺失菌的抗應(yīng)激能力。通過(guò)考察菌株在含H2O2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，比較PHO4缺失菌與親本菌的敏感性，結(jié)果顯示PHO4缺失菌對(duì)H2O2的敏感性顯著增加，表明其抵抗氧化應(yīng)激的能力下降。過(guò)氧化氫、金屬和非金屬鹽、溫度變化、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、藥物作用等都是刺激白念珠菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的因素，而應(yīng)激反應(yīng)能力的改變也是藥物敏感性改變的原因之一［9-10］。已有的研究結(jié)果揭示缺失轉(zhuǎn)錄因子Pho4的白念珠菌對(duì)亞砷酸鹽和砷酸鹽敏感，與白念珠菌中HOG通路的激活狀態(tài)有關(guān)，該通路的激活參與調(diào)控砷酸鹽脫毒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。HOG通路是白念珠菌應(yīng)對(duì)外界壓力，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的主要通路［11-12］。缺失轉(zhuǎn)錄因子Pho4導(dǎo)致白念珠菌對(duì)砷酸鹽敏感，HOG通路受到抑制，Pho4的表達(dá)量增多則會(huì)促進(jìn)Hog1的磷酸化，激活HOG通路［13］。因此推測(cè)，PHO4缺失菌對(duì)唑類藥物的敏感性增加也可能與其HOG通路被抑制，使其抗應(yīng)激能力下降，導(dǎo)致藥物外排能力減弱有關(guān)。白念珠菌對(duì)藥物敏感性的調(diào)節(jié)涉及多種機(jī)制，對(duì)于Pho4參與耐藥調(diào)控的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。相關(guān)文獻(xiàn)】KontoyiannisDP,LewisRE.Antifungaldrugresistanceofpathogenicfungi[J].Lancet,2002,359(9312):1135-1144.MorschhauserJ.ThegeneticbasisoffluconazoleresistancedevelopmentinCandidaalbicans[J].BiochimBiophysActa,2002,1587(2-3):240-248.MorschhauserJ.Regulationofmultidrugresistanceinpathogenicfungi[J].FungalGenetBiol,2010:47(2):94-106.CosteAT,KarababaM,IscherF,etal.TAC1,transcriptionalactivatorofCDRgenes,isanewtranscriptionfactorinvolvedintheregulationofCandidaalbicansABCtransportersCDR1andCDR2[J].EukaryotCell,2004,3(6):1639-1652.ZnaidiS,WeberS,Al-AbdinOZ,etal.GenomewidelocationanalysisofCandidaalbicansUpc2p,aregulatorofsterolmetabolismandazoledrugresistance[J].EukaryotCell,2008,7(5):836-847.SasseC,SchilligR,ReimundA,etal.InducibleandconstitutiveactivationoftwopolymorphicpromoterallelesoftheCandidaalbicansmultidrugeffluxpumpMDR1[J].AntimicrobAgentsChemother,2012,56(8):4490-4494.SellamA,TebbjiF,NantelA.RoleofNdt80pinsterolmetabolismregulationandazoleresistanceinCandidaalbicans[J].Eukaryotcell,2009,8(8):1174-1183.RomanowskiK,ZaborinA,ValuckaiteV,etal.Candidaalbicansisolatesfromthegutofcriticallyillpatientsrespondtophosphatelimitationbyexpressingfilamentsandalethalphenotype[J].PloSOne,2012,7(1):e30119.SmithDA,NichollsS,MorganBA,etal.Aconservedstress-activatedproteinkinaseregulates