Real-time-PCR實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)

實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)胡曉研究生實(shí)驗(yàn)技術(shù)2015-12-71精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)原理一、實(shí)驗(yàn)原理：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。熒光信號

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標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析？2精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)原理Ct值(CycleThreshold;每個反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù))與樣本初始拷貝數(shù)存在正比線性關(guān)系。以不同稀釋倍數(shù)的已知模板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時監(jiān)測未知樣本的Ct值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到未知樣本的初始拷貝數(shù)。（定量分析）3精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類非特異性的DNA結(jié)合染料法：熒光染料能非特異結(jié)合DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，而游離的熒光染料不發(fā)出熒光。

常用染料：PicoGreen（靈敏度高,>=25pg/mL）SYBRI缺點(diǎn)：易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的影響。措施：設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。

4精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類5精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類2.特異性熒光定量PCR:以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)水解探針法分子信標(biāo)Scorpion引物/探針復(fù)合探針6精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)影響因素樣品RNA的完整性RNA樣品中的基因組DNA污染特異性良好的引物PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄所得cDNA的量必須精確地等于相應(yīng)的mRNA的量可靠的內(nèi)標(biāo)基因：TEF-27精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作8精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作陽性模板9精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作制作標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照：測定陽性模板的濃度，10倍稀釋為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。反應(yīng)體系如下:(標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系)序號反應(yīng)物劑量SYBRGreen1染料

10μl陽性模板上游引物F0.5μl陽性模板下游引物R0.5μldNTP0.5μlTaq酶

1μl陽性模板DNA5μl

ddH2O32.5μl總體積

50μl3.輕彈管底將溶液混合，短暫離心。(內(nèi)參照基因反應(yīng)體系)

序號反應(yīng)物劑量

SYBRGreen1染料10μl內(nèi)參照上游引物F0.5μl內(nèi)參照下游引物R0.5μldNTP0.5μlTaq酶

1μl待測樣品cDNA5μlddH2O32.5μl

總體積

50μl10精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作1、制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板：①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。序號反應(yīng)物劑量110×PCR緩沖液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3

上游引物F0.5ul4

下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ulddH2O

至25ul②輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）;72oC延伸5分鐘。③PCR產(chǎn)物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。11精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR:①所有cDNA樣品分別配臵實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系。體系配臵如下：序號反應(yīng)物劑量SYBRGreen1染料10ul上游引物

1ul下游引物

1uldNTP1ulTaq聚合酶

2ul待測樣品cDNA

5ulddH2O30ul

總體積50ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。12精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作上機(jī)前樣本的制備檢測程序的設(shè)置檢測孔及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置運(yùn)行檢測程序結(jié)果的顯示與輸出結(jié)果分析熔解曲線擴(kuò)增曲線13精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作14精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）15精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）16精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）假陽性：熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的雙鏈如引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物等結(jié)合。要避免這些非特異熒光信號對定量精確性的影響，可以利用熱循環(huán)儀內(nèi)設(shè)定的熔解反應(yīng)程序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。熔解曲線峰為單一峰形，未見其他峰值，并且峰的形狀也比較銳利。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。17精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）有研究建議在每一個循環(huán)中PCR延伸后增加一步，即將溫度提高后再檢測反應(yīng)體系中的熒光。該檢測溫度大于引物二聚體的退火溫度Tm，而小于特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值。在此溫度下，引物二聚體都變性成單鏈，因此只檢測到與特異性PCR產(chǎn)物結(jié)合的SYBRGreenI所發(fā)出的熒光，消除了引物二聚體的干擾，降低了非特異性熒光，有助于目標(biāo)基因的準(zhǔn)確定量。18精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）標(biāo)準(zhǔn)品的選擇：

理論上可以以目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，但是存在降解、污染等因素影響定量結(jié)果。論壇網(wǎng)友給出了幾種解決方法：另設(shè)計(jì)一對引物用于熒光PCR；將擴(kuò)增序列插入T載體后作為標(biāo)準(zhǔn)品；設(shè)計(jì)一對外圍引物擴(kuò)增PCR,將產(chǎn)物連入T載體(①+②)19精選2021版課件qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）20精選2021版課件21精選2021版課件半定量PCR1、同管擴(kuò)增：減少操作誤差，引物間影響大2、異管擴(kuò)增：擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可信，具有操作誤差22精選2021版課件半定量PCR實(shí)驗(yàn)過程總RNA提取；模板cDNA制作；半定量PT-PCR：23精選2021版課件半定量PCR優(yōu)化步驟引物設(shè)計(jì)及選擇：a)