微生物大小的測定及顯微鏡直接計數(shù)法

微生物學實驗報告題目：微生物大小的測定及顯微鏡直接計數(shù)法姓名：學號：年級班級：組別：同組者：時間：【目的要求】學習并掌握使用顯微鏡測微尺測定微生物大小的方法。了解血球計數(shù)板的構造、明確其計數(shù)原理。學習并掌握使用血球計數(shù)板測定微生物細胞或孢子數(shù)量的方法?！净驹怼縧．測微尺的構造：顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成 目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份。目鏡測微尺每格實際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進行標定。鏡臺測微尺為一專用的載玻片，中央有精確等分線將長為1mm的直線等分成100個小格，每格長10μm，專用于校正目鏡測微尺。2.球菌用直徑表示大小；桿菌用寬和長來表示圖一：測微尺的校正3．顯微直接計數(shù)法：將小量待測樣品懸浮液置于計菌器上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細菌、霉菌孢子等。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細菌計數(shù)板或Hawksley計數(shù)板。三種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間較寬的平臺，被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)（大方格）分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。計數(shù)區(qū)由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常測定五個中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一個大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設5個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)=eq\f(A,5)×25×104×B=5×104×A·B（25個中格）=eq\f(A,5)×16×104×B=3.2×104×A·B（16個中格）【實驗器材】菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），枯草芽孢桿菌(Bacillussubitilis)儀器、材料：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、擦鏡紙、香柏油、血球計數(shù)板、蓋玻片、吸水紙、計數(shù)器、無菌滴管等?！静僮鞑襟E】微生物大小的測定。（1）目鏡測微尺的安裝把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內。（2）校正目鏡測微尺將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，利用推進器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)（圖一）。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于已知鏡臺測微尺每格長10μm，根據(jù)下列公式即可分別計算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度（μm）=eq\f(兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10,兩重合線間目鏡測微尺格數(shù))（3）菌體大小的測定將鏡臺測微尺取下，換上細菌染色制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。值得注意的是，和動植物一樣，同一種群中的不同菌體細胞之間也存在個體差異，因此在測定每一種菌種細胞大小時應對多個細胞進行測量，然后計算取平均值。顯微鏡計數(shù)。（1）無菌生理鹽水適當稀釋制備釀酒酵母菌懸液。（2）鏡檢血球計數(shù)板。（3）加樣品。血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，從計數(shù)板平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一滴，利用表面張力溝槽中流出多余的菌懸液。加樣后靜置5min，使細胞或孢子自然沉降。（4）將加有樣品的血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格（可選4個角和中央的一個中格）中的菌體進行計數(shù)。若有菌體位于格線上，則計數(shù)原則為計上不計下，計左不計右。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。（5）清洗。使用完畢后，將血球計數(shù)板及蓋玻片進行清洗、干燥，放回盒中，以備下次使用?！緦嶒灲Y果】目鏡測微尺校正結果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表長度（μm）低倍鏡×1020105高倍鏡×404051.25油鏡×1002010.5各菌測定結果名稱目鏡測微尺每格代表的長度（μm）寬長菌體大小/（μm×μm）目鏡測微尺平均格數(shù)寬度/μm目鏡測微尺平均格數(shù)長度/μm枯草芽孢桿菌0.510.57.73.40.5×3.4釀酒酵母0.56.33.294.53.2×4.5酵母菌顯微計數(shù)結果（A表示5個中格中總菌數(shù)，B表示菌液稀釋倍數(shù)）菌種各中格菌數(shù)AB菌數(shù)/mL12345酵母菌979812411511254651.365×108【思考題】為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？答：因為在不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡下，目鏡測微尺每格代表的長度會發(fā)生變化。在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細菌的大小時，其測定結果是否相同？為什么？答：相同。因為用不同的物鏡時都重新校正目鏡測微尺，目鏡測微尺每格代表的長度可按照重新校正的數(shù)據(jù)計算。哪些因素會造成血球計數(shù)板的計數(shù)誤差，應如