急性吸入毒性試驗(yàn)方法

附件3急性吸入毒性試驗(yàn)方法AcuteInhalationToxicityStudy1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性吸入毒性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品單一成分的原料安全性毒理學(xué)檢測。2試驗(yàn)?zāi)康募毙晕攵拘栽囼?yàn)可評價(jià)化妝品原料能否被直接吸入或者通過其他途徑進(jìn)入呼吸道所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，可對受試物進(jìn)行毒性分級，為亞急性毒性和其他毒理學(xué)研究中染毒濃度選擇提供依據(jù)。3定義3.1急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity實(shí)驗(yàn)動物短時(shí)間（24h內(nèi)）持續(xù)吸入一種可吸入性受試物后，在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2半數(shù)致死濃度（LC50）medianlethalconcentration在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量，以單位體積空氣中受試物的質(zhì)量（mg/m3）來表示。3.3空氣動力學(xué)直徑aerodynamicequivalentdiameter(AD)氣溶膠顆粒與不同直徑標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時(shí)，該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑即為空氣動力學(xué)直徑。其計(jì)量單位為μm。3.4質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑massmedianaerodynamicdiameter(MMAD)氣溶膠中小于和等于某一空氣動力學(xué)直徑的顆?？傎|(zhì)量，占全部顆粒物質(zhì)量50%時(shí)，該直徑即為空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑。3.5幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometricstandarddeviation(GSD)用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對應(yīng)的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標(biāo)準(zhǔn)差。4試驗(yàn)的基本原則受試物通過吸入暴露裝置制備成不同濃度的樣品，各試驗(yàn)組動物在一定時(shí)間內(nèi)吸入不同濃度的受試物，暴露濃度的選擇可通過預(yù)試驗(yàn)確定，吸入暴露后觀察動物的毒性反應(yīng)和死亡情況，試驗(yàn)期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活的動物要處死進(jìn)行大體解剖。5試驗(yàn)方法5.1受試物試驗(yàn)前受試物的有用信息包括：受試物的特性（如純度），化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；任何體外或者體內(nèi)性試驗(yàn)結(jié)果：預(yù)期用途和人體暴露的可能性；得到的結(jié)構(gòu)類似物的構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)和毒理數(shù)據(jù)，在研究中，盡可能使用一組受試物，而且其樣本應(yīng)該在能保持其純度、穩(wěn)定性的條件下保存。受試物的準(zhǔn)備：可對受試物進(jìn)行適當(dāng)處理，使其達(dá)到適當(dāng)濃度和粒徑。如果是顆粒材料可經(jīng)過機(jī)械加工，以達(dá)到所需的粒度分布，但不要分解或者改變供試品，如果在機(jī)械過程中已經(jīng)被認(rèn)為改變了物品組分時(shí)，應(yīng)對受試物成分進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證如果不產(chǎn)生可吸入顆粒，則不需要進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)，否則應(yīng)進(jìn)行吸入毒性試驗(yàn)。5.2實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境常規(guī)選擇嚙齒類動物，首選大鼠，一般選用8~12周齡的大鼠，使用雌性動物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。如需使用其他品系需說明理由。試驗(yàn)開始時(shí)動物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%。試驗(yàn)前動物要在實(shí)驗(yàn)動物房環(huán)境中至少適應(yīng)3~5d時(shí)間。染毒前，動物應(yīng)提前適應(yīng)口鼻暴露時(shí)所用的固定器，以減少進(jìn)入新環(huán)境引起的不適。實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.3染毒濃度在試驗(yàn)開始前，通常要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，為主試驗(yàn)的濃度選擇提供幫助，受試物已知或預(yù)期有毒則進(jìn)行限度試驗(yàn)。用全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽系統(tǒng)（GHS）的分類系統(tǒng)，氣體、蒸氣、溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L和5mg/L。傳統(tǒng)LC50試驗(yàn)至少設(shè)置3個(gè)不同濃度的染毒組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進(jìn)行預(yù)試，以便能在各濃度組的試驗(yàn)動物中發(fā)生一定程度毒效應(yīng)和死亡。所得資料應(yīng)足以繪制出濃度－死亡曲線，并在可能情況下求出LC50值。5.4暴露方式根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇吸入染毒方式，首選的暴露方式為口鼻式暴露，特別是在研究液體或固體氣溶膠或者可凝結(jié)成為氣溶膠的蒸氣時(shí)。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒裝置以更好地滿足研究需求，但應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。采用全身暴露染毒時(shí)應(yīng)保證染毒柜中氣流的穩(wěn)定性，試驗(yàn)動物的總體積不能超過染毒柜容積的5%。5.5暴露條件口鼻式暴露時(shí)間推薦為4h，暴露期間應(yīng)禁食，在全身暴露時(shí)可以提供水。如果需更長時(shí)間的研究，應(yīng)提供理由。5.6方法5.6.1傳統(tǒng)的LC50法在傳統(tǒng)法中，暴露時(shí)間為4h。動物暴露在一個(gè)限定濃度（限度試驗(yàn)），或在至少3個(gè)不同的濃度下（主試驗(yàn)）。除已知受試物信息外，在開展主試驗(yàn)前，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)：預(yù)試驗(yàn)可用來估計(jì)受試物的毒性效應(yīng)，確定易感性的性別差異，并為限度試驗(yàn)或主試驗(yàn)的濃度選擇提供幫助。在選擇預(yù)試驗(yàn)的濃度水平時(shí)，應(yīng)該充分使用所有可得的信息，比如現(xiàn)有的定量－構(gòu)效關(guān)系（Q）SAR數(shù)據(jù)和類似化學(xué)品的數(shù)據(jù)。試驗(yàn)中，每個(gè)濃度水平的每種性別的試驗(yàn)動物不超過3只，通常只有一個(gè)濃度水平。已經(jīng)進(jìn)行過的急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法研究可以用來替代預(yù)試驗(yàn)。限度試驗(yàn)：當(dāng)受試物已知或預(yù)期基本無毒時(shí)，可采用限度試驗(yàn)。受試物的毒性作用信息，可以來源于已測試過的類似化合物或混合物或產(chǎn)品的特性和具有毒理意義的組成成分。在限度試驗(yàn)中，雌雄各3只動物暴露在限定濃度中。如果在限定濃度發(fā)現(xiàn)動物死亡或?yàn)l死，則限度試驗(yàn)的結(jié)果可作為其他濃度試驗(yàn)（如主試驗(yàn)）的預(yù)試驗(yàn)。如果受試物的理化性質(zhì)決定其不可能達(dá)到限定濃度，則需測試其最大可及濃度。如果最大可及濃度的死亡率小于50%，則不需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。主試驗(yàn)：進(jìn)行主試驗(yàn)時(shí)，一般每個(gè)濃度組有10只動物，雌雄各半（或5只易感性別的動物），且至少有3個(gè)濃度水平。必須有足夠多的濃度水平足以繪制出濃度死亡曲線，并在可能情況下求出LC50各暴露組之間的時(shí)間間隔取決于中毒體征的出現(xiàn)、持續(xù)時(shí)間與嚴(yán)重程度。是否需要對下濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)，取決于先前的試驗(yàn)動物是否能夠成活。5.6.2濃度－時(shí)間法濃度－時(shí)間法是傳統(tǒng)LC50法的另一種替代方法。這種方法使試驗(yàn)動物暴露在不同濃度的受試物水平，而且暴露時(shí)間也不同。所有的試驗(yàn)都采用口鼻部吸入的方法。與傳統(tǒng)法相比，濃度－時(shí)間法得到的LC01與LC100的值更加穩(wěn)定。當(dāng)在4個(gè)濃度水平和5種暴露持續(xù)時(shí)間的主試驗(yàn)采用濃度－時(shí)間法時(shí)，每個(gè)濃度－時(shí)間間隔只需使用2只動物（雌雄各半或易受影響的單一性別）。在某些情況下，在每濃度－時(shí)間間隔，可以選擇兩種性別的動物各2只，這能減少參數(shù)估計(jì)的誤差和變異性，增加成功率，提高置信區(qū)間的覆蓋范圍。當(dāng)用來參數(shù)估計(jì)的數(shù)據(jù)擬合不好時(shí)，可能需要第5個(gè)濃度水平。預(yù)試驗(yàn)：預(yù)試驗(yàn)一般用各性別、各濃度3只動物，它可以為主試驗(yàn)選擇1個(gè)合適的初始濃度和最大化減少動物使用。暴露時(shí)間為4h。如果能從急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法中得到死亡數(shù)據(jù)，那么可以不進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。在選擇研究中的初始目標(biāo)濃度時(shí)，應(yīng)該考慮在急性吸入毒性試驗(yàn)－急性毒性分類法中觀察到的各性別和各個(gè)濃度的死亡率。主試驗(yàn)：初始濃度（第一步暴露）可能是限定濃度，也可根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇濃度。每組雌雄各1只動物暴露于此濃度下，持續(xù)時(shí)間不同（如15、30、60、120、240min），總共用到10只動物。限定濃度可根據(jù)監(jiān)管要求選擇，氣體、蒸氣、氣溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L、5mg/L（或?yàn)樽畲罂杉皾舛龋?，如果在第一步暴露中發(fā)現(xiàn)死亡，則引起死亡的最小暴露濃度將為下一步試驗(yàn)的濃度建立提供指導(dǎo)，每一個(gè)后續(xù)的試驗(yàn)都將取決于先前的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)供試品物理或化學(xué)性質(zhì)無法達(dá)到極限濃度時(shí)，應(yīng)測試可達(dá)到的最大濃度。如果在可達(dá)到的最大濃度下，致死率低于50%，則不需要進(jìn)行下一步的測試，如果不能達(dá)到極限濃度，研究報(bào)告應(yīng)提供說明和數(shù)據(jù)支持，如果可達(dá)到的最大蒸汽濃度不會引起毒性，則可能需要將供試品作為液體氣溶膠產(chǎn)生。對于很多受試物，如果暴露時(shí)間間隔適當(dāng)，在初始濃度得到的結(jié)果與在其他3個(gè)濃度組得到的結(jié)果，就能足以繪制濃度－時(shí)間－死亡曲線。5.7暴露條件的監(jiān)測5.7.1濃度監(jiān)測試驗(yàn)期間為保證實(shí)際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實(shí)時(shí)監(jiān)測設(shè)備（如氣溶膠光度計(jì)），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行化學(xué)分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測定呼吸區(qū)或染毒柜內(nèi)氣溶膠濃度，以保證暴露條件的穩(wěn)定性。對于氣體和蒸汽，單個(gè)腔室濃度樣品的平均濃度不得超過±10%，對于液體或固體氣溶膠，平均濃度不應(yīng)超過±20%，應(yīng)計(jì)算和記錄腔室的平衡時(shí)間（t95）。5.7.2粒徑監(jiān)測在發(fā)生系統(tǒng)中，應(yīng)進(jìn)行粒度分析，以確保氣溶膠濃度的穩(wěn)定性。推薦可吸入質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑（MMAD）應(yīng)該在1~4μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差（σ）在1.5~3.0。在染毒期間，需經(jīng)常進(jìn)行粒度分析，以測定粒度分布的一致性。如達(dá)不到要求，應(yīng)說明理由。氣溶膠粒徑的測定需在染毒4小時(shí)內(nèi)至少采樣2次，可采用級聯(lián)撞擊采樣器或其他設(shè)備如氣體動力學(xué)粒徑儀等，粒徑分析所得質(zhì)量濃度應(yīng)處于由濾膜分析法所得質(zhì)量濃度的合理的限度范圍內(nèi)。5.7.3暴露系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測染毒裝置內(nèi)氣流：染毒裝置應(yīng)配備動態(tài)氣流，口鼻吸入染毒過程中應(yīng)使裝置內(nèi)保持輕度負(fù)壓，全身暴露裝置染毒柜內(nèi)應(yīng)密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時(shí)記錄1次，在暴露系統(tǒng)中，氧氣濃度應(yīng)至少為19%，二氧化碳濃度不得超過1%，如果達(dá)不到要求，應(yīng)定期監(jiān)測氧氣和二氧化碳濃度。染毒裝置內(nèi)溫度保持在22±3℃，口鼻暴露和全身暴露都需監(jiān)測記錄動物呼吸區(qū)的相對濕度，試驗(yàn)期間應(yīng)至少監(jiān)測和記錄三次，較短時(shí)間內(nèi)每半小時(shí)測一次。理想的相對濕度一般在30%～70%，但在某些情況下，可能無法達(dá)到（例如在測試水溶液型受試物時(shí)），應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中予以闡釋說明。5.8臨床觀察在暴露剛開始當(dāng)天至少進(jìn)行兩次臨床觀察，或者根據(jù)動物反應(yīng)，進(jìn)行更頻繁觀察。觀察期限最少為14d，以后每天至少進(jìn)行一次觀察。中毒體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間都十分重要，特別是在有中毒體征延遲趨勢時(shí)。動物瀕死、疼痛劇烈與嚴(yán)重且持久的痛苦皆應(yīng)予以安樂死。當(dāng)動物被安樂死，或者發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)該盡可能準(zhǔn)確記錄死亡時(shí)間。所有的觀察應(yīng)該被系統(tǒng)地記錄，每個(gè)動物應(yīng)該保持單獨(dú)記錄。觀察內(nèi)容應(yīng)該包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循環(huán)，自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肢體活動和行為的改變。應(yīng)該記錄可能的局部和全身反應(yīng)的差別。要注意有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、昏睡、睡眠和昏迷癥狀。測試直腸溫度可為出現(xiàn)反射性呼吸遲緩、C-纖維刺激反射或與給藥方式或封閉相關(guān)的低溫/高熱情況提供佐證。每只動物體重應(yīng)該在暴露前一天到暴露（day0），并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周），以及在第1天后的死亡或安樂死時(shí)進(jìn)行記錄。若動物體重出現(xiàn)≥20%的持續(xù)遞減，應(yīng)該進(jìn)行密切監(jiān)測。在暴露結(jié)束后，應(yīng)測量存活動物的體重，并實(shí)施安樂死。5.9病理檢查所有實(shí)驗(yàn)的動物，包括在實(shí)驗(yàn)中死亡的，或者出于動物福利原因被安樂死以及從試驗(yàn)中撤離的，應(yīng)該進(jìn)行大體解剖。如果動物被發(fā)現(xiàn)死亡后，應(yīng)盡可能快地進(jìn)行尸體解剖，通常在1~2d內(nèi)，如不能被立即進(jìn)行尸體解剖，動物應(yīng)該被冷藏，以盡量減少自溶。記錄每個(gè)動物的大體病理變化，并特別注意呼吸道改變。其他附加檢查可為研究提供更為深入的解釋價(jià)值，例如測量存活大鼠肺的重量，和/或提供呼吸道刺激性的顯微鏡檢查證據(jù)，對死亡和存活24h及24h以上的動物中存在大體病理改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。如受試物對水有反應(yīng)（如酸和吸濕性受試物），可開展整個(gè)呼吸道的顯微鏡檢查。5.10LC50的計(jì)算一般可采用多種方法測定LC50，建議采用一次最大限度試驗(yàn)法、霍恩氏法、概率單位－對數(shù)圖解法和寇氏法等。5.11試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)5.11.1結(jié)果處理應(yīng)該提供每只動物的體重和尸檢發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)。臨床觀察數(shù)據(jù)應(yīng)該以表格的形式呈現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)出各實(shí)驗(yàn)組使用的動物的數(shù)量，出現(xiàn)特殊中毒特征的動物數(shù)量，實(shí)驗(yàn)中死亡或者人道處死的動物數(shù)量，動物個(gè)體的死亡時(shí)間，毒副作用的描述和時(shí)間進(jìn)程，可逆體征以及尸檢發(fā)現(xiàn)。5.11.2結(jié)果評價(jià)評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)將LC50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢結(jié)果相結(jié)合考慮，LC50值是受試物急性毒性分級及判定受試物經(jīng)呼吸道吸入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)，引用LC50值時(shí)一定要注明所用實(shí)驗(yàn)動物的種屬、性別、暴露方式及時(shí)間長短、觀察期限等。評價(jià)應(yīng)包括受試物吸入暴露劑量與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其他毒性作用）的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。毒性分級見表1。表1吸入毒性分級分級氣體（ppm）蒸氣（mg/L，4h）粉塵和霧（mg/L，4h）第1類LC50≤100LC50≤0.5LC50≤0.05第2類100＜LC50≤5000.5＜LC50≤2.00.05＜LC50≤0.5第3類500＜LC50≤25002.0＜LC50≤100.5＜LC50≤1.0第4類2500＜LC50≤2000010＜LC50≤201.0＜LC50≤5第5類＞20000＞20＞5注：分類標(biāo)準(zhǔn)引用《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》(GHS)。第5類的標(biāo)準(zhǔn)旨在