病理科工作流程

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接受標(biāo)本（編號、登記）——固定——標(biāo)本取材、記錄——脫水——常規(guī)制片（包

特殊染色

埋、切片、染色）——免疫組化

|——————?dú)w檔第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天目錄一、組織脫水、透明、浸蠟二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)三、組織包埋制作技術(shù)四、石蠟組織切片制作技術(shù)五、蘇木素-伊紅染色技術(shù)六、程序控制的自動(dòng)組織切片染色機(jī)七、全自動(dòng)組織玻片封片機(jī)第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、組織脫水、透明、浸蠟組織脫水

1.脫水的目的和原則：組織經(jīng)固定后，含有大量水分，組織在透明浸蠟前必須進(jìn)行脫水，就是用某些溶劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來，以利于透明劑和石蠟的滲入，這個(gè)過程稱為脫水。原則1.脫干凈但又不過脫水；2.脫水劑自低濃度至高濃度進(jìn)行。

2.常用脫水劑：乙醇、丙酮

3.常用脫水順序是：70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ。第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、組織脫水、透明、浸蠟組織透明

1.透明的目的和原則：組織脫水后必須經(jīng)過一種既能與乙醇相結(jié)合，又能溶解石蠟的溶劑，通過這種溶劑的媒介作用石蠟進(jìn)入組織。這種溶劑使組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)，這個(gè)過程稱為透明。

2.常用透明劑：二甲苯

教材：在進(jìn)入二甲苯透明前，需要先經(jīng)過無水乙醇和二甲苯的混合液30min。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明的總共試劑必須控制在1.5h以內(nèi)。第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、組織脫水、透明、浸蠟組織浸蠟

1.組織浸蠟的目的：組織經(jīng)過脫水、透明后用的石蠟、火膠棉、明膠等支持劑浸入組織內(nèi)，使組織變硬并將組織包裹在內(nèi)，有利于切片，這個(gè)過程稱為浸蠟。

2.組織浸蠟的方法：經(jīng)數(shù)次石蠟浸泡（一般為3~4個(gè)步驟，每步50~60min）置換出組織內(nèi)的透明劑，使純凈的石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)一般為58~60℃。

3.浸蠟劑的種類：石蠟（最廣泛應(yīng)用）、火膠棉、明膠第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)1、全密閉式程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)的結(jié)構(gòu)控制面板、處理槽、石蠟箱、試劑柜等2、全密閉式程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)的功能

可設(shè)定密碼、延時(shí)功能、小標(biāo)本當(dāng)日完成、加溫功能、報(bào)警功能等3、全密閉式程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)程序的設(shè)置第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)試劑濃度時(shí)間甲醛10%1h甲醛10%1h甲醛10%1h乙醇80%1h乙醇95%1h乙醇95%1h無水乙醇100%1h無水乙醇100%1h無水乙醇100%1h第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天試劑濃度時(shí)間二甲苯30min二甲苯45min二甲苯60min石蠟30min石蠟1h石蠟1h第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)4、全密閉式程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)液體的更換規(guī)律及原則理論上講每次更換液體應(yīng)該將脫水機(jī)內(nèi)的液體全部更換。（1）一般固定液每周更換一次。若組織塊較多（每天200~300塊），固定液沒三天更換一次。（2）脫水劑梯度酒精每周更換一次（150塊/天，如果每天處理300塊左右，應(yīng)該3天更換一次乙醇）。方法是將第2缸的80%乙醇倒棄，95%乙醇及無水乙醇依次遷移。（3）透明二甲苯10~15天更換一次，二甲苯第一缸倒棄，第二缸前移。（4）石蠟必須干凈無雜質(zhì)。建議1500~2000塊將第一缸石蠟廢棄。第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)5、全密閉式程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)液體的操作方法從取材室與取材醫(yī)師完成標(biāo)本核對后，將組織拿至脫水機(jī)，此刻脫水機(jī)界面如下圖所示

第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天1.確認(rèn)清洗程序完成，打開處理槽蓋。2.擦凈槽蓋面及槽內(nèi)水氣，槽內(nèi)殘?jiān)?.將脫水欄按順序平穩(wěn)放好，蓋緊槽蓋、確認(rèn)鎖定。4.選擇層數(shù)(level)、選擇并確認(rèn)使用的程序(ProgressSelect)

，立即開始(ImmediateStart)處理組織。5.脫水程序處理完成，按（drainallchamber）將處理槽內(nèi)的石蠟排空。6.打開處理槽蓋，取出脫水欄，將槽內(nèi)殘蠟擦拭干凈。7.蓋好處理槽蓋，按（flushstart）清洗，整個(gè)處理程序完成。第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、全密閉程序控制自動(dòng)組織脫水機(jī)備注：1.如果脫水過程中，有需要繼續(xù)添加的組織，選擇LidRelease鍵，然后將蓋子打開，將組織放入脫水機(jī)，然后按屏幕上Restart所對應(yīng)的按鍵即可2.每次脫水完成前、后都應(yīng)擦拭反應(yīng)缸，脫水完成后，取出組織，應(yīng)將組織籃放入反應(yīng)缸中運(yùn)行沖洗程序，以脫去反應(yīng)缸及其組織籃中的石蠟以方便取材。3.應(yīng)定期檢測石蠟液面，正常情況下每周檢測一次，如一段時(shí)間內(nèi)標(biāo)本過多或者過少，可以適當(dāng)減少或者增加檢測周期，防止出現(xiàn)石蠟液面不夠的情況。4.脫水機(jī)需要定期擦拭保養(yǎng)，并填寫設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)記錄。第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天三、組織包埋制作技術(shù)包埋的定義：組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明劑（石蠟、火膠棉、樹脂、塑料等）浸透，用包埋劑（石蠟、火膠棉、樹脂、塑料等）包成塊的過程稱為包埋。常用包埋方法：石蠟包埋法、火膠棉包埋法、樹脂包埋法、塑料包埋法、快速包埋法、液體標(biāo)本包埋法組織包埋的發(fā)展及現(xiàn)狀：手工包埋、半自動(dòng)組織包埋熔蠟器、全自動(dòng)組織包埋、冷臺一體機(jī)最常用的包埋石蠟熔點(diǎn)為56~58℃、58~60℃第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天三、組織包埋制作技術(shù)全自動(dòng)組織包埋、冷臺一體機(jī)三大組成部分：1.石蠟缸及出蠟口；2.左右儲存槽（100~120塊）；3.工作臺面以及鑷子加熱孔功能：溫度調(diào)節(jié)（65~70℃）、時(shí)鐘調(diào)節(jié)（24h）、工作時(shí)間設(shè)定（每周的工作日期）、開關(guān)機(jī)時(shí)間設(shè)定（6~10：30）、冷臺裝置（0~-15℃）、流量控制。維護(hù)與保養(yǎng)：選擇質(zhì)量好的切片石蠟，注意定期清理熔蠟儲槽，并加入少許二甲苯清洗管道，以保證石蠟流出暢通，并在每日工作完成后清洗機(jī)器外貌。散熱孔要經(jīng)常清理。第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天三、組織包埋制作技術(shù)石蠟包埋法及質(zhì)量控制1.包埋時(shí)要核對組織塊與標(biāo)本盒的標(biāo)記是否一致（黃盒x幾）。2.嚴(yán)禁污染及交叉污染（隨時(shí)紗布擦拭臺面）。3.根據(jù)組織的大小選擇不同的包埋模具。4.根據(jù)組織的不同結(jié)構(gòu)層次、特點(diǎn)、標(biāo)記面，包埋時(shí)應(yīng)加以注意，如食管黏膜或標(biāo)注立埋的則需要立（垂直）埋。5.皮膚組織包埋時(shí)應(yīng)將組織塊45°傾斜放入石蠟中包埋，2塊及以上組織并列傾斜包埋。6.食管黏膜、胃腸類黏膜視黏膜組織大小、長短、厚薄，或90°垂直包埋，或卷曲包埋。7.腎、肝、前列腺、乳腺等穿刺標(biāo)本視組織大小，包埋時(shí)平整的放入石蠟中，輕輕按平，切片時(shí)才能切全，用力過重會(huì)使組織破碎，過輕會(huì)使組織包埋不平，切片不完整。第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天三、組織包埋制作技術(shù)8.對宮頸1~12點(diǎn)錐切標(biāo)本應(yīng)按組織的內(nèi)膜面至漿膜面成90°放入石蠟中包埋。9.內(nèi)鏡下進(jìn)行的食管早期腫瘤微創(chuàng)手術(shù)切除的黏膜標(biāo)本，要按照一個(gè)方向的切面或特殊標(biāo)記進(jìn)行包埋。組織包埋應(yīng)注意的問題：1.包埋注意核對內(nèi)容；2.防止組織污染隨時(shí)清潔工作臺面，加熱包埋鑷，注意脫水蓋有無組織存留；3.灌蠟適量，不可過多或過少，防止多余蠟邊形成；4.修蠟塊及包埋機(jī)的維護(hù)及保養(yǎng)第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天四、石蠟組織切片制作技術(shù)病理組織經(jīng)取材、固定、脫水處理，用石蠟包埋后制作成蠟塊，用切片機(jī)制作切片的過程稱作為石蠟組織切片。一般切片的厚度為3~5um。撈片機(jī)內(nèi)置蒸餾水，水溫設(shè)置在45℃左右，有利于石蠟切片蠟帶的鋪平、伸展。撈片位置要適當(dāng)，組織面要放在載玻片下2/3的交界處，注意整齊美觀。切片機(jī)的保養(yǎng)及維護(hù)。第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天五、蘇木精—伊紅染色技術(shù)蘇木精、伊紅染色原理及配制方法《實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)》P63-65蘇木精伊紅染色的分化控制與返藍(lán)一、分化的目的與控制：分化就是用某些試劑（1%的鹽酸酒精液）促使色素與組織解離，將細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料、細(xì)胞質(zhì)中吸附的染料及不需要著色的部位除掉，以利于伊紅的染色。不論使用手工控制或用機(jī)染控制，均要根據(jù)分化液的新鮮程度來決定分化時(shí)間。（新鮮配制的時(shí)間短一些；蘇木精染色時(shí)間久分化的時(shí)間要長一些。）顯微鏡檢測下控制分化，分化不可過度，適宜后迅速入自來水沖洗去除酸后中止分化。第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天五、蘇木精—伊紅染色技術(shù)二、返藍(lán)的目的與控制：蘇木精染色后經(jīng)1%鹽酸酒精液分化；切片是在酸性環(huán)境中，這時(shí)顏色是紅褐色。切片進(jìn)入弱堿性自來水沖洗或用返藍(lán)液（0.5%氫氧化氨水溶液）在堿性環(huán)境中就會(huì)由紅褐色變成藍(lán)色。三、分化液、返藍(lán)液的配制：

1.分化液濃鹽酸1ml，70%乙醇99ml。

2.返藍(lán)液：氫氧化氨0.5ml，蒸餾水99.5ml。第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天五、蘇木精—伊紅染色技術(shù)蘇木精伊紅染色手工操作程序及注意事項(xiàng)染色程序：二甲苯Ⅰ（脫蠟）——二甲苯Ⅱ（脫蠟）——

3min3min無水乙醇Ⅰ——無水乙醇Ⅱ——自來水沖洗——蘇木素——

1min1min3-5min自來水沖洗——1%鹽酸酒精分化——自來水沖洗（去分

3s左右5-10min化）——伊紅（醇溶）——自來水沖洗——85%乙醇（脫水）——

20s10s95%乙醇（脫水）——無水乙醇（脫水）——無水乙醇（脫水）——

10s1min1min二甲苯Ⅰ（透明）——二甲苯Ⅱ（透明）——二甲苯Ⅲ（脫蠟）

1min1min1min第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天五、蘇木精—伊紅染色技術(shù)染色的注意事項(xiàng)：

1.脫蠟要徹底。透明狀，與溫度、時(shí)間、二甲苯使用的時(shí)間及脫蠟片數(shù)有關(guān)。

2.二甲苯的容器要密閉，嚴(yán)禁液體外溢。必須在通風(fēng)櫥柜中進(jìn)行操作。

3.蘇木精-伊紅的染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織不同、固定液不同、固定時(shí)間、環(huán)境溫度、染色液新舊、切片厚薄及染片數(shù)量來決定。

4.蘇木精染色后不宜在水中停留時(shí)間過長，防止染色質(zhì)變藍(lán)后不易分化；伊紅染色后水洗時(shí)間要短，否則易脫色。整個(gè)過程要在顯微鏡下觀察控制染色效果（理論）。

第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天五、蘇木精—伊紅染色技術(shù)5.HE染色成敗關(guān)鍵在于鹽酸酒精分化及返藍(lán)，一定要在鏡下控制，嚴(yán)格掌握時(shí)間。肉眼觀察：切片由原來的深藍(lán)色變成紅色至粉紅色時(shí)即恰到好處，再?zèng)_水返藍(lán)

6.切片脫水時(shí)在低濃度酒精中的時(shí)間不宜過長，因其對伊紅有分色及褪色作用。

7.在無水乙醇中脫水時(shí)間應(yīng)稍長，保證最后一步酒精要純，防止將水分帶入二甲苯。

8.二甲苯后兩步宜慢，以利于無水乙醇徹底脫凈。封片后若切片成云霧狀，說明最后一步二甲苯不純。第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天六、程序控制的自動(dòng)組織切片染色機(jī)徠卡-AUTOStainerXL型自動(dòng)染色機(jī)一、結(jié)構(gòu)與功能

1.帶有全透明的機(jī)蓋，可隨時(shí)觀察染色機(jī)的工作情況；

2.設(shè)有干燥加熱裝置。對切片再一次烘烤，去除切片殘余水分；切片帶有熱量進(jìn)入二甲苯脫蠟速度快；能保持染色機(jī)內(nèi)溫度恒定，染色效果好。

3.帶有多個(gè)試劑槽，可移動(dòng)，可變換，密封效果好；

4.具有裝載、下載的通道；

5.設(shè)有水洗缸，可進(jìn)行水流控制；

6.機(jī)械手臂可橫向及縱向運(yùn)動(dòng)，帶有抖動(dòng)功能，幅度可調(diào)。

7.內(nèi)置軟件，精確的孵育時(shí)間；第24頁,共28頁，2024年2月25日，星期天六、程序控制的自動(dòng)組織切片染色機(jī)二、操作程序1.染色前檢查染色缸中的染色液量是否充足，染色缸的位置排列是否正常，確認(rèn)進(jìn)水開關(guān)開啟；2.打開主電源插座的電源開關(guān)及儀器的總開關(guān)；3.顯示屏上顯示出主菜單，按stain鍵，機(jī)械手移動(dòng)到每個(gè)染色缸的部位進(jìn)行自檢，儀器進(jìn)入工作狀態(tài)；4.將裝載切片的染色欄放入染色機(jī)，按