PCR實驗檢測標準操作規(guī)范

1、PCR僉測實驗室操作規(guī)范一、PCR實驗室的設置及管理1 .目的：建立實驗室的合理設置和科學管理，防止實驗污染，保證檢測結果的可靠性。2 .適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設置、工作流程和日常管理等。3 .負責人：4 .細則：4. 1流感實驗室為急傳所的專業(yè)實驗室，從事臨床標本的基因擴增檢測及相關科研工作等。4. 2本實驗室采用實時熒光定量（定性）PCR技術作為病毒基因診斷的主要手段，實驗室分為三個區(qū)：試劑準備區(qū)（第一區(qū)）、標本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工 作區(qū)配備專用的設備、儀器、輔助設施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯 的區(qū)分標識。標本的接收則在檢驗科標本

2、接收處進行。4. 3各工作區(qū)專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等，不可混用。4. 4各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務管理見各相關SOP文件。4. 5嚴格遵守從“試劑準備區(qū)一標本處理區(qū)一擴增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進入 前一工作區(qū)。4. 6非本實驗室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi)；進修、實習或其他科室人員因科研活動需要，進入實驗區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本處理區(qū)、擴增分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項規(guī)定并嚴格遵守執(zhí)行，在本實驗室人員監(jiān)督指導下進行。4. 7實驗完畢后做好清潔消毒工作。二、PCR實驗室工作制度1 .目的：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測結果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯、事故

3、 及糾紛的發(fā)生。2 .適用范圍：所有本實驗室人員。3 .負責人：4 .細則：4. 1本實驗室進行臨床基因擴增檢測及相關實驗工作，不得進行其它實驗操作。4. 2各區(qū)的用品不得混用。4. 3在各區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴格按照操作規(guī)程。4. 4試劑準備區(qū)只能進行試劑的貯存及配制等相關操作（見相關SOP文件）。4. 5標本處理區(qū)只能進行臨床標本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成（見相關 SOP文件）。4. 6擴增分析區(qū)只能進行 DNA或cDNA的擴增、實時熒光 PCR擴增產(chǎn)物的分析（見相關 SOP 文件）。4. 7進行實驗時嚴格執(zhí)行本實驗室的各

4、項操作規(guī)程，及時做好各種操作記錄，力求準確、可 靠。實驗完畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計等工作。4. 8室內(nèi)儀器由專人負責，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護使用儀器，定期進行保養(yǎng) 與維修。4. 9愛護科室財產(chǎn)，注意安全；離開實驗室前應關好門窗，檢查水、電等。三、PCR實驗室內(nèi)務管理制度1 .目的：保證實驗室日常內(nèi)務管理及清潔工作順利進行。2 .適用范圍：實驗室相關人員及相關清潔工人。3 .負責人：4 .細則：4. 1非本室工作人員未經(jīng)允許不得進入實驗室。4. 2各區(qū)的用品不得混用。4. 3實驗人員要有強烈的時間觀念，按時上下班，不遲到、早退。4. 4進入實驗室的工作人員必須遵守實驗室的單一流向

5、的規(guī)定，禁止逆向走動。4. 5所有儀器（如PCR擴增儀）須有專人負責，并有使用維護記錄；實驗人員必須熟悉儀器 性能后方允許操作，并嚴格遵守操作規(guī)程。4. 6所有試劑進購、配制、質檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實驗室。4. 7每天了解儀器運轉情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。4. 8各區(qū)的各種清潔消毒均應有記錄，工作衣消毒時注意各區(qū)應分開進行處理。4. 9注意保持實驗室衛(wèi)生整潔，嚴禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實驗操作人員應盡量少入。4.10下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日應指定人員負責檢查實驗室的儀器、設備。四、PCR實驗室人員的配置及管理1 .目的：保證實驗室有足夠數(shù)

6、量的合格的具備開展該類實驗能力的實驗人員。2 .適用范圍：適用于實驗室人員配置、管理、培訓及考核。3 .負責人：4 .細則：5 . 1人員要求4. 1. 1本實驗室工作人員應為醫(yī)學檢驗專業(yè)或相關專業(yè)畢業(yè)，具有中級以上技術職稱或專科 以上學歷。4. 1. 2實驗室工作人員應參加衛(wèi)生部或省臨檢中心舉辦的PCR技術培訓，并取得合格證。4. 1. 3對于新進入本室的人員，如尚未取得PCR技術培訓合格證，應在實驗室有培訓合格證的上級技術人員的指導下進行實驗工作，實驗報告由有資格人員出具，并應在最短的時間內(nèi) 取得上崗培訓合格證。4. 2人員配置4. 2. 1實驗室應根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員。4. 2

7、. 2各級技術人員履行相應的工作職責。4. 3人員培訓及考核4. 3. 1實驗室負責人或負責人指定人員參加每年衛(wèi)生部PCR室間質評總結會。4. 3. 2實驗室工作人員每12年至少參加1次PCR技術的省級或國家級繼續(xù)教育項目， 參加相關學術交流會議。4. 3. 3安排未取得上崗培訓合格證的工作人員在合適的時間內(nèi)參加技術培訓。4. 3. 4科室不定期組織實驗室內(nèi)部實驗人員學習、更新核酸擴增方面的相關知識，提升自身 的理論學習水平。特別是在標本接收區(qū)采血、接收標本的人員，需定期對其進行有關核酸擴增 技術，標本采集、保存、運輸?shù)戎R的培訓。一些科室的送檢標本由該科室的人員送到標本接 收區(qū)，對這些臨床醫(yī)

8、護人員也要定期進行有關核酸擴增技術，標本采集、保存、運輸?shù)戎R的 培訓。4. 3. 5本實驗室工作人員每年進行考核一次 ，考核內(nèi)容：a）日常工作質量b）室內(nèi)質控測評c）室間質控測評d）在抱怨處理中的表現(xiàn)4. 3. 6本實驗室工作人員實行嚴格獎懲制度，有下列表現(xiàn)者可受獎：a）工作質量高，質控測評成績優(yōu)秀者b）有科研能力，并有一定數(shù)量和質量的論文發(fā)表c）有獨創(chuàng)性工作成果，經(jīng)鑒定認可者d）受到有關部門或群眾嘉獎者有下列情況者將受到懲處：a）工作質量問題較多，質控測評成績不合格；b）不遵守規(guī)章制度并造成一定影響；c）不求上進。4. 3. 7本實驗室工作人員獎懲方法分精神及物質兩類，經(jīng)實驗室上報及有關部

9、門批準后執(zhí)行。4.3.8本實驗室工作人員均建立業(yè)績檔案，實行能進能出制度，不斷吸收高質量人員，加強培訓和提高，對于不適合本室工作的人員要及時調離。4. 4人員管理4. 4. 1實驗室建立所有工作人員的技術檔案，包括：學歷、任職資格、發(fā)表論文、研究成 果、培訓等相關材料復印件。4. 4. 2技術檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1次，電子檔案隨時更新。五、PCR實驗室清潔程序1 .目的：保證實驗室環(huán)境的整潔，防止污染。2 .適用范圍：適于實驗室工作環(huán)境、實驗臺面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3 .負責人：操作人：4 .細則：4. 1實驗室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的

10、物品阻礙。4. 2合理規(guī)劃實驗室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處，常用的物品要容易尋找到。4. 3抽屜、柜子、文件類物品要作好標記，以方便識別。4. 4實驗結束后用2%X二醛對臺面進行清潔，并用移動紫外燈進行消毒。4. 5每天對使用過的移液器用 75%酉精進行擦拭。每周 1次對移液器咀進行 75%酉精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應隨時浸泡處理。4. 6實驗過程中如發(fā)生標本或試劑外濺，應立即用2%戈二醛滴上，濾紙蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用移動紫外燈消毒。4. 7每天實驗前開啟各區(qū)的通風系統(tǒng)，各區(qū)實驗結束后，分別打開傳遞窗紫外燈、移動紫外燈（對實驗

11、臺面消毒）、天花板紫外燈消毒實驗室，每次開啟3060分鐘。4. 8待紫外燈消毒時間足夠后，依次關閉各區(qū)紫外燈并記錄。4. 9依次清潔三個區(qū)的實驗臺面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單 一方向流程的原則來進行清潔。4. 10處理好各區(qū)廢棄物。4. 11每周將工作服洗滌消毒，不同實驗區(qū)的工作服隔開洗滌。六、PCR標本唯一標識編號規(guī)則1 .目的：保證標本編號的唯一性，也是準確發(fā)放報告的基礎。2 .適用范圍：使用核酸擴增熒光檢測實驗室所開展的病毒以及基因檢測項目：3 .負責人： 操作人：4 .程序：4. 1按檢測日期分類標記根據(jù)標本送檢的日期，每天的標本對應標記一種唯一的代號。4.

12、2按檢測類型分類標記根據(jù)檢測項目的不同，每種檢測項目對應標記一種唯一的代號。4. 3按驗單接收順序編號在同種檢測類型的驗單中，按驗單順序編號。4. 4特殊標本的編號如有特殊情況，應在標記前面增加特異字母區(qū)別開。4. 5編號步驟a）對當天送來的標本，根據(jù)編號的基本原則編號，每個樣本的每個檢測項目對應一個唯一的 編號。b）用筆在每張檢驗申請單和對應的樣品管上作好相同的標記。c）做好標本的接收記錄，每個樣本的記錄都應包括以下信息：接收時間、醫(yī)院、科室、送檢 醫(yī)生、患者姓名、性別、年齡、標本類別、標本狀態(tài)、送標本者、接收人、檢驗單號、標本唯 一統(tǒng)編號等。d）處理好樣品、點樣后，將反應管放入擴增儀上開始

13、擴增。f）擴增得到結果后，先在統(tǒng)計簿上填入結果，作好記錄，再一一把實驗結果填入相應申請單。g）發(fā)放檢驗報告單。七、PCR基因擴增實驗室的要求1 .目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進行的工作及其操作。2 .適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進行的工作。3 .負責人：操作人：4 .程序：一、臨床基因擴增檢驗實驗室的設計（一）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設計原則。原則上臨床基因擴增檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的 分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。

14、例如使用實時熒光PCR儀，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自 動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是：1 .試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及 離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。2 .標本制備區(qū)：核酸（RNA DNA提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床 樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。3 .擴增區(qū)：cDNA合成、DNAT增及檢測。4 .擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。(二)臨床基因擴增檢驗

15、實驗室的空氣流向。臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向可 按照試劑儲存和準備區(qū)一標本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣 流進入擴增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭﹥Υ婧蜏蕚鋮^(qū)一標本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)方 向空氣壓力遞減的方式進行。可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行的方式實現(xiàn)。(三)工作區(qū)域儀器設備配置標準。1 .試劑儲存和準備區(qū)。(1) 28c和-20 C以下冰箱。(2)混勻器。(3)微量加樣器(覆蓋 0.2- 1000W1)。(4)可移動紫外燈(近工作臺面)。(5)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。(6)專用工作服和工作鞋(套)。(7)專用辦公用品。

16、2.標本制備區(qū)。(1) 2-8 C冰箱、-20 C或-80 C冰箱。(2)高速離心機。(3)混勻器。(4)水浴箱或加熱模塊。(5)微量加樣器(覆蓋 0.2- 1000W1)。(6)可移動紫外燈(近工作臺面)。(7)生物安全柜。(8)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)。(9)專用工作服和工作鞋(套)。(10)專用辦公用品。(11)如需處理大分子 DNA應當具有超聲波水浴儀。3.擴增區(qū)。(1)核酸擴增儀。微量加樣器(覆蓋 0.2- 1000科1),(視情況定)。(3)可移動紫外燈(近工作臺面)。(4)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)。（5）專用

17、工作服和工作鞋。（6）專用辦公用品。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)。視檢驗方法不同而定，基本配置如下：（1）微量加樣器（覆蓋 0.2- 1000W1）。（2）可移動紫外燈（近工作臺面）。（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。（4）專用工作服和工作鞋。（5）專用辦公用品。上述各區(qū)域儀器設備配備為基本配備，實驗室應當根據(jù)自己使用的擴增檢測技術或試 劑的特點，對儀器設備進行必要的增減。二、臨床基因擴增檢驗實驗室工作基本原則（一）進入各工作區(qū)域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)一標本制備區(qū) 一擴增區(qū)-擴增產(chǎn)物分析區(qū)。（二）各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品不得混用。（三）不

18、同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū) 域時，不得將工作服帶出。（四）實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區(qū)一標本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū) 的方向進行。不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。（五）工作結束后，必須立即對工作區(qū)進行清潔。工作區(qū)的實驗臺表面應當可耐受諸如 次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應當方便有效。由于紫外照射的 距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調至實驗臺上6090cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（bp）,對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必

19、須延長照射時間，最好是照射過夜。（六）實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合實驗室生物安全通 用要求（GB19489-2008）。三、臨床基因擴增檢驗實驗室各區(qū)域工作注意事項（一）試劑儲存和準備區(qū)。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試 劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)，試劑盒中的陽性對照品及質控品不應當保存在該區(qū)， 應當保存在標本處理區(qū)。（二）標本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染， 可通過在本區(qū)內(nèi)設立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污 染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危

20、險性的材料，必須 在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。（三）擴增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的 是，所有經(jīng)過檢測的反應管不得在此區(qū)域打開。（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探 針雜交方法（放射性核素標記或非放射性核素標記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯 酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法、質譜分析等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染 來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1 mol/L H

21、Cl中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應當至遠離 PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如澳化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放 射性核素等，故應當注意實驗人員的安全防護。八、PCR廢棄物的處理程序1 .目的：保證實驗室、實驗人員和外部環(huán)境的安全。2 .適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用化學試劑（ NaOH EDTA乙醇、生理鹽水等）、 實驗室廢棄物的處理；3 .負責人：操作人：4 .細則：4.1 科室職責應對本室工作人員講明本程序在預防交叉、實驗室污染及切斷傳播途徑中的重 要性，并要求嚴格

22、執(zhí)行。4.2 實驗室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黃色）。使用過的一次性消耗品（如試管、吸頭、離心管、等 ），先放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡24小時后，再放入黃色垃圾袋內(nèi)，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋 內(nèi)集中處理。4.3 夾取標本的工具，如鉗、鐐、接種環(huán)、吸管等，用后均應消毒清潔，進行微生物檢驗時， 應重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。4.4 一次性塑料痰盂，用 2%X二醛浸泡24小時后，放入黃色垃圾袋內(nèi)集中處理。4.5 廢棄標本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關節(jié)腔液等用10%勺84液浸

23、泡24小時后，集中處理。4.6 盛標本的容器，若為一次性使用的紙質容器及其外面包被的廢紙，放入污物袋里處理；對可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸 15分鐘或加入10項氯酸鈉溶液浸泡24小時，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養(yǎng)采樣者， 用壓力蒸汽滅菌后備用。4.7 廢棄標本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)、封閉，污物處理中心處理。九、基因擴增檢測實驗及結果分析1、目的：保證擴增及結果分析的標準化、規(guī)范化。2 .適用范圍：適用于本室使用的普通離心機。3 .負責人：操作人：4、標準程序：4.2.8發(fā)放報告：及時登記檢測結果記錄，發(fā)放臨床報告。4.3 實驗結果無效的判斷標準：出

24、現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結果不可 發(fā)，查找原因，重做實驗。4.3.1 陰性對照出現(xiàn)擴增。4.3.2 陽性對照無擴增。4.3.3 大批甚至所有的標本都擴增了。4.3.4 室內(nèi)質控血清檢測結果出現(xiàn)失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內(nèi)質控標準操作程 序。4.4 實驗結果有效的判斷標準：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發(fā)放結果。4.4.1 陰性對照沒有擴增，陽性對照擴增。4.4.2 陽性標準品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關系數(shù)三個參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。4.4.3 室內(nèi)質控血清檢測結果處于在控狀態(tài)，具體標準詳見十、臨床標本的保存操作程序1 .目的：臨床標本正確保存，以便必要時復查

25、。2 .適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 1處理前的標本保存a）全血標本可4 c下短期（24h內(nèi)）保存，長期保存則需分離出血清（血漿），保存于 -20 C 下。b）咽拭子、痰或胸腹水、腦脊液、膿液標本短保存于-70 C下。4. 2報告發(fā)出后的標本保存：a）提取的核酸標本當天檢測可置 4c保存，如當天不檢測應置 -20 C保存。報告發(fā)出后第二 天丟棄。b）原始血清/血漿樣本在報告發(fā)出后放入低溫冰箱-20C保存1個星期，以備復查。超過 1個星期保存期的標本由室負責人酌情處理，一般按生物傳染性物品統(tǒng)一處理。c）血清/血漿標本放置低溫冰箱保存時須有記錄，

26、按編號順序存放，并由專人負責管理。4. 3特殊標本的處理：對暫不檢測的項目和規(guī)定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤 檢驗。對特殊樣本或特殊病人的樣本，實行“首接”負責制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣 本，以及特殊病人的樣本一律實行“首接”負責制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均 須負其責任，不得以任何借口推托，及時和正確保管和轉送樣本到有關實驗室或有關人員，同 時作交班記錄和雙簽名。十一、臨床標本的采集、運送、接收程序1 .目的：規(guī)范臨床待檢標本的正確采集、送檢和處理。2 .適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 1標本的

27、采集4. 1. 1標本由臨床各科室接受過臨床基因擴增檢測有關標本采集、保存、運輸知識培訓的醫(yī) 護人員采集并送至實驗室。4.1.2標本采集要求a）血液標本：用 2ml真空采集管或1.5ml高壓滅菌離心管采集血液標本，血標本采集后在2小時內(nèi)送達實驗室。離心（檢驗單與標本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5ml的離心管中，編號。b）痰標本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標本送檢。（對于無痰或少痰的患者，可用45c加溫的100g/L NaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對于小兒 可以輕壓胸骨柄上方以誘導咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標本。）

28、標本在室溫下保存不能超過 24小時。4. 2標本的運送標本采集后，密閉、標（貼）姓名，應盡可能快的送至檢測實驗室，如運送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實驗室。4. 5接收4. 5. 1嚴格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進行驗收，查對，不符合要求 的樣本一律退回，并有書面記錄。十二、PCR生物安全防護措施1 .目的：預防工作人員在實驗過程中被感染或污染。2 .適用范圍：適用于本室所有工作人員。3 .負責人：操作人：4 .細則：4. 1實驗人員在實施生物防護措施時，應嚴格遵守各項相應的規(guī)章制度，建立起強烈的生物防護意識。4. 2每天更換廢液缸的 2%X二醛溶液，并保證 2%戊二醛溶

29、液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之左右。配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封 性良好。4. 3實驗臺面日常清潔時使用 75%勺酒精擦拭。4. 4每區(qū)每次實驗后紫外燈照射 3060分鐘，如有需要可延長照射時間。4. 5所有來自病人的血液或體液標本均應視作傳染源，因此在標本的采集、運輸過程中，標 本容器應完好無泄漏。4. 6處理標本時應穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體 液標本以及試劑，應立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生 物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細菌污染。消毒劑可用“84

30、”消毒液。4. 7在實驗過程中，病人標本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應立即用清水洗。4. 8實驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應立即脫下手 套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進行預防補救措施。4. 9在實驗過程中病人標本（血液、體液）外漏時，應立即用2娥二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。4. 10實驗完畢離開時，應脫下所有該實驗區(qū)個人防護裝備。4. 11實驗完畢后應對實驗室進行紫外消毒。4. 12遇有意外事故應立即報告科室負責人，當事人應立即注射相關疫苗或進行預防性治療， 并進行醫(yī)學觀察，嚴重者應報告技術負責

31、人。十三、PCR實驗室化學試劑配制程序1 .目的：保證實驗中用到的各種溶液符合實驗要求。2 .適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用溶液：4%NaOH、75%酉精、消毒劑（三氯異鼠尿酸或 二氯異氧尿酸鈉）、2%X二醛溶液等。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 4化學試劑的配制:4. 4. 1用具：干燥潔凈的 250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架，100ml塑料試劑瓶、2000ml廣口瓶各一只。4. 4. 2配制步驟：4. 4. 2. 1 配制 4%NaO然液：a）用天平稱取4克分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。b）用250ml量桶準

32、確取100ml水，緩緩注入盛放 NaOH固體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角燒瓶使 NaOH固體充分溶解。d）然后緩緩傾倒入100ml塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?. 4. 2. 2配制消毒劑：a） 一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達到500mg/L,即可達到消毒作用。b）消毒劑為粉狀（20克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取 500g,倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4. 4. 2. 3配制2峨二醛溶液：a）準確量取戊二醛原液 20ml倒入1000ml燒杯中。b）量取980ml水，緩緩倒入1000ml燒杯中，混勻，加至 2000ml廣

33、口瓶中備用。注意事項：每份配制好的溶液保質期為14天十四、PCR應急處理程序1 .目的：在實際工作中，儀器設備發(fā)生故障、試劑盒發(fā)生質量問題時，為保證檢驗結果的準 確性、及時，應正確采取應急措施，最大程度上避免或減輕不利影響。2 .適用范圍：適用于滿足核酸擴增熒光檢測實驗室檢測需要并可能對檢驗結果造成誤差的儀 器設備和試劑盒。3 .負責人：4 .細則：4. 1核酸擴增熒光檢測實驗室工作人員在職責范圍內(nèi)均有責任熟悉各種儀器和相關設備的性 能、要求、維護和保養(yǎng)、常見故障的排除、尤其要嚴格按照操作規(guī)程操作。4. 2工作人員在職責范圍內(nèi)均有責任有意識地注意以求及時發(fā)現(xiàn)并報告儀器設備和試劑盒的 異常情況。

34、4. 3作為應急處理，潛在著一定的可能影響檢測質量的不確定因素。室負責人負責在第一時 間檢查核實應急措施的有效性。4. 4儀器設備故障4. 4. 1室負責人接到異常情況報警后，立即現(xiàn)場確認異常情況的性質：觀察有誤、誤操作、 偶發(fā)現(xiàn)象或確屬不能立即排除的故障。4. 4. 2用紅牌故障標志標示故障儀器，以防被錯誤使用。4. 4. 3有滿足要求的替用設備的，啟用替用設備（準用儀器）。借用其他部門儀器設備時， 及時聯(lián)系借用并核實該設備的使用狀態(tài)。替用、借用或備用設備的使用在滿足質量要求的同 時，必須同時滿足實驗室管理措施（特別是防污染）的要求。4. 4. 4不能解決的問題，應及時與供應方會同解決。根據(jù)

35、雙方合同約定，及時通知供應方。 供應方技術支持人員將在規(guī)定的時間內(nèi)隨身攜帶備用設備到達現(xiàn)場。4. 4. 5儀器維修后，必須經(jīng)驗收合格并供需雙方簽字，調試實驗通過后才能重新啟用。取下 紅色故障標示（暫停使用），換上藍色正常標示（正常使用）。4. 4. 6科室主任須檢查并隨時跟蹤所采取措施的有效性。4. 4. 7對未能及時排除故障時，必須及時上報科室，在科主任批準下，應積極聯(lián)系附近的其 他已得到衛(wèi)生部臨檢中心認證的臨床基因擴增檢驗實驗室檢驗，以滿足病人和臨床或科研需 求。4. 5試劑盒質量發(fā)生問題，經(jīng)核實后，及時通知供貨商迅速更換另一批次試劑，使用前需先 作質量檢測，合格后方可使用。4. 6儀器設

36、備故障或試劑質量問題不能得到解決，預期將會影響到檢測報告的及時發(fā)出，可 將標本送至其它已得到衛(wèi)生部臨檢中心認證的臨床基因擴增檢驗實驗室檢。4. 7影響到檢測報告發(fā)出的情況，應在應急處理記錄表作記錄。十五、試劑的質檢標準操作程序1 .目的：保證每批用于臨床實驗的試劑的質量良好，符合要求。2 .適用范圍：各種用于臨床實驗的核酸擴增熒光檢測試劑。3 .負責人：操作人：4 .程序：4. 1收到試劑后，目測試劑是否處在凍存狀態(tài)。4. 2核對試劑品種和數(shù)量并檢查包裝：外包裝（廠名廠址、批準文號、批號和有效期等）；內(nèi)包裝（試劑瓶完整性、試劑配備品種完整性、使用說明書有否等）。4. 3及時將試劑轉入-20c冰

37、箱保存。將上述檢測核對情況在記錄本上登記。4. 4最遲在前批次試劑存量尚可維持常規(guī)實驗一周時，按如下要求對新批號試劑進行效驗實驗。4. 5效驗實驗：4. 5. 1要求設置：空白對照、陰性對照、陽性對照、室內(nèi)質控各一，陽性標準品梯度 （104、105、106、108）。4. 5. 2出現(xiàn)如下情況中任何一種的，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測：a）空白對照出現(xiàn)擴增。如擴增曲線CT值大于25,需重復實驗確證試劑污染。b）陽性對照和陽性標準品均未檢出，或陽性對照未檢出而陽性標準品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。4. 5. 3陽性對照未檢出，陽性標準品檢測正常，提示樣品提取液可能存在

38、問題。重復新舊提 取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。4. 5. 4空白對照無擴增，陰性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨用提取液點樣上機，出現(xiàn)擴增，需更換提取液后方可使用該批試劑。4. 5. 5陽性對照檢出，陽性標準品未檢出或擴增曲線明顯系統(tǒng)性CT值偏大5個循環(huán)以上。提示陽性標準品存在問題。更換陽性標準品后該批試劑方可投入使用。4. 5. 6空白對照、陰性對照無擴增，陽性對照正常檢出，陽性標準品導出的標準曲線之斜率 （2.93.9）、截距（2634）、相關性（0.99）均在使用范圍內(nèi)，表明該批試劑良好，可以投入臨床使用。4 . 6將實驗

39、結果歸入記錄。十六、離心機操作維護程序1 .目的：保證離心機的正常使用。2 .適用范圍：適用于本室使用的普通離心機。3 .負責人：操作人：4 .性能參數(shù)：見說明書。5 .程序:5. 1離心機應放置在水平堅固的地板或平臺上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時造成 儀器振蕩。5. 2打開電源開關，將預先平衡好的樣品對稱放置于轉頭的樣品架上，關閉機蓋。5. 3旋動定時旋鈕設定離心時間，緩慢旋轉轉速調節(jié)旋鈕使儀器轉速達到預定要求。5. 4離心完畢后，將轉速調節(jié)旋鈕調回零位，關閉電源開關。5. 5待離心機完全停止轉動時打開機蓋，取出離心樣品，再次關閉機蓋結束離心。5. 6離心室的清潔：為了避免樣本等殘留

40、物的污染，應經(jīng)常對離心機外殼和離心室進行清潔 處理。對離心室清潔，應先打開離心機蓋，撥掉電源線，用專用設備將離心機轉子旋下，再用 中性去污劑(70%勺異丙醇/水混合物或乙醇去污染)清潔離心室；離心室內(nèi)的橡膠密封圈經(jīng)去 污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤滑。5 . 7轉子的清潔：轉子會被樣本殘留物污染，也可能會被某些化學試劑腐蝕，因此應對轉子 每月進行清潔維護。每月用中性的清潔劑清潔轉子一次，并在儀器維護記錄本上作好記錄，以 延長轉子的壽命。6 .儀器維護(1)為確保安全和離心效果，儀器必須放置在堅固水平的臺面上，塑料蓋門上不得放置任何物品樣品必須對稱放置，并在開機前確保已擰緊螺母。(2)應經(jīng)常檢

41、查轉頭及試驗用的離心管是否有裂紋，老化等現(xiàn)象，如有須及時更換.(3)試驗完畢后，需將儀器擦拭干凈，以防腐蝕.(4)如樣品比重超過1.2g/cm 3,最高轉速n按下式計算：n=nmax*，-1.2/樣呂比重.(5)當電機碳刷長度小于 6mm時，必須及時更換.(6)在離心機未停穩(wěn)時不得開蓋.(7)儀器必須有可靠接地.(8)實驗結束后，請關閉后面的電源開關，撥掉電源插頭時，請不要忘了打開后面的電源開關.(9)該儀器在日常使用中請注意符合“5.6,5.7 ”要求。(10)嚴格按照儀器的開關機程序關機。7 .期間核查(1)本儀器不需要特別的周期間隔。(2)校準物均為與ICSH之標準相符合的校準物，測定值

42、偏差均不超過其規(guī)定值。十七、冰箱操作維護規(guī)程1 .目的：對冰箱進行適當?shù)木S護，以確保冰箱的正常使用。2 .適用范圍：本實驗室使用的各種品牌、型號的冰箱。3 .負責人：操作人：4 .性能參數(shù)：見說明書。5 .程序:4. 1開、關機：冰箱按說明書要求放好后，插上電源線，冷藏室溫度開關置于4C,冷凍室溫度開關置于-20 C, 2小時后用溫度計確認。系統(tǒng)進入正常運行狀態(tài)后即可使用。4. 2外冰箱應放置于水平地面并留有一定的散熱空間。外接電源電壓必須匹配，并要求有良 好的接地線。4. 3冰箱內(nèi)禁止存放與本實驗室無關的物品。4. 4放入冰箱內(nèi)的所有試劑、樣品、質控品等必須密封保存。4. 5保持冰箱出水口通

43、暢；非自動除霜冰箱應在每月底除霜；月底清潔冰箱，清潔時切斷電源，用軟布蘸水擦拭冰箱內(nèi)外，必要時可用中性洗滌劑。4. 6每日觀察冰箱內(nèi)溫度并記錄于冰箱的質控圖上。4. 7若溫度超出規(guī)定范圍，調節(jié)溫控使其回到正常范圍，并進行記錄。4. 8若溫控調節(jié)無效，報請設備科維修，修理后須驗收合格并簽字后方能正常使用。6.儀器維護(1)使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4.注意事項”要求(2)廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣， 防止低真空出現(xiàn)。(3)當出現(xiàn)堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴格按照儀器的關機程序關機。7.期間核查(1冰箱不需要特別的周期間隔。

44、(2)校準物均為與ICSH之標準相符合的校準物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。十八、生物安全柜操作維護規(guī)程1 .目的：正確使用生物安全柜。2 .適用范圍：本 SOP適用于本實驗室使用的生物安全柜。3 .負責人：操作人：4 .性能參數(shù)：見說明書。5.程序:5. 1新安裝或長期未使用的生物安全柜，使用前必須用超凈真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的物品 認真進行清潔工作。6. 2接通電源，使用前應提前 1530分鐘同時開啟紫外燈和風機組工作。7. 3當需要調節(jié)風機風速時，用生物安全柜操作面板上的風速調節(jié)鈕進行調節(jié)。風機、照明均由指示燈指示其工作狀態(tài)。8. 4工作臺面上禁止存放不必要的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流

45、不受干擾。9. 5禁止在工作臺面上記錄書寫，工作時應盡量避免作明顯擾動氣流的動作；禁止在預過濾進風口部位放置物品，以免擋住進風口造成進風量減少，降低凈化能力。10. 6使用結束后，用消毒液清理工作臺面后打開紫外燈，1530分鐘后關閉紫外燈，關閉生物安全柜電源。每次使用生物安全柜后，均需對其進行清潔。11. 7根據(jù)環(huán)境潔凈程度，定期將預過濾器中的濾料拆下清洗，一般間隔時間為36個月。12. 8定期(一般每半年1次)計測工作區(qū)風速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術參數(shù)要求，則可調大風機供電電壓。當風機組電壓調到最大時，工作區(qū)風速仍達不到0.3m/s ,則必須更換高效空氣過濾器(由廠家或院儀器維修人員進行)。4 .

46、 9有相應的維護記錄，長期不使用的生物安全柜撥下電源插頭。6 .儀器維護(1)使用注意。該儀器在日常使用中請注意符合“4.注意事項”要求(2)廢液瓶滿要及時倒掉廢液，切勿強行扯動紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。(3)當出現(xiàn)堵孔時，按自動沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴格按照儀器的關機程序關機。7 .期間核查（1）PE-5700基因擴增儀的定標不需要特別的周期間隔，本實驗室PE-5700基因擴增儀執(zhí)行衛(wèi)生部臨床檢驗中心的指定校準。（2）校準物均為與ICSH之標準相符合的校準物，測定值偏差均不超過其規(guī)定值。十九、移液器操作維護規(guī)程1 .目的：確保移液的精確性，正確使用移液器。2 .適用范圍：本實驗室使用的可調式移液器。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 1移液器的使用1.1