植物花藥和花粉培養(yǎng)

關(guān)于植物花藥和花粉培養(yǎng)四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子第2頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天植物單倍體培養(yǎng)方法:花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）第3頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類(lèi)、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。第4頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天概念：花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”。兩者的異同點(diǎn)培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)沒(méi)有藥壁組織干擾；可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過(guò)程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。第5頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天花藥或花粉培養(yǎng)的作用：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。第6頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開(kāi)。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB

AABB AaBB AABb AaBbaB

aABB aaBB aABb aaBbAb

AabB AabB AAbb

Aabbab

aAbB aabB aAbb aabb第7頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->

AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培第8頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

（3）誘變育種中的作用

第9頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、物種進(jìn)化研究可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。

3、遺傳分析

單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來(lái)。能用來(lái)研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。4、構(gòu)建連鎖圖譜

雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建5、用于遺傳轉(zhuǎn)化

能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響第10頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天花粉孢子體發(fā)育途徑

（雄核發(fā)育）第11頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時(shí)，雄核發(fā)育最適宜的時(shí)期一般是第一次有分裂或之前。第12頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、雄核發(fā)育途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞（1）A-V途徑

由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）

由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過(guò)核融合，形成多倍體植株2、B途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株第13頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天第14頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、雄核發(fā)育與P花粉的形成

P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理 饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動(dòng)雄核發(fā)育。三、雄核發(fā)育啟動(dòng)機(jī)理第15頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式第16頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過(guò)胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第17頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第18頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天胚狀體發(fā)育途徑a)球形胚d)魚(yú)雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)第19頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)第20頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)第21頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天花藥和花粉培養(yǎng)方法第22頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、花藥培養(yǎng)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無(wú)菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第23頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化

1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來(lái)；（2）超速旋切法通過(guò)攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來(lái)（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩、梯度離心處理純化小孢子第24頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）第25頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)花粉培養(yǎng)方式

1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)

利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過(guò)花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第26頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天看護(hù)培養(yǎng)圖解第27頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、白化苗現(xiàn)象第28頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期。2、外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類(lèi)、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。3、機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無(wú)性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通過(guò)對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。第29頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素（一）基因型植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對(duì)小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻。第30頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚狀體數(shù)量/106小孢子成苗率（%）第31頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）供體植株生長(zhǎng)條件和生理狀態(tài)1、植株生長(zhǎng)條件光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長(zhǎng)條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長(zhǎng)時(shí)期一般是開(kāi)花始期優(yōu)于開(kāi)花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時(shí)數(shù)、氮饑餓及生長(zhǎng)物質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量第32頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）花粉發(fā)育時(shí)期小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。第33頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子第34頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天單核晚期

液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期

生殖核

生殖核營(yíng)養(yǎng)核

第35頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。

第36頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期第37頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試確定最佳小孢子發(fā)育時(shí)期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會(huì)因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時(shí)期的確定第38頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）預(yù)處理

預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件

預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。

預(yù)處理方法：主要是對(duì)花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。

第39頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、高低溫處理

低溫預(yù)處理：指在接種之前將材料用0℃以上低溫處理一段時(shí)間后再接種。應(yīng)用較多。處理溫度一般在1-14℃，時(shí)間從幾小時(shí)至幾十天不等。不同作物所用的預(yù)處理溫度及時(shí)間差異較大。不同的處理溫度需要不同的時(shí)間。

例子:小麥穗子培養(yǎng)前4℃預(yù)處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。

十字花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個(gè)，6-9℃處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個(gè)，預(yù)處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個(gè)。

預(yù)處理方法：第40頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天高溫處理（熱擊處理）：指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35℃）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。

例子:如煙草，32℃高溫；小麥，33℃高溫預(yù)處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996）第41頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、化學(xué)物質(zhì)處理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進(jìn)行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營(yíng)養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。3、其它包括γ射線、離心、磁場(chǎng)等。第42頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）培養(yǎng)基

1.基本培養(yǎng)基主要為N6和MS培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。如H培養(yǎng)基（適于煙草）、C17培養(yǎng)基（適于小麥）、馬鈴署-Ⅱ培養(yǎng)基（適于馬鈴署）第43頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.碳源包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類(lèi)及濃度的所差異。一般認(rèn)為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類(lèi)作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。第44頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH

第45頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）培養(yǎng)條件

1、溫度物種間有差異2、光照3、植板密度

植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5×103到2×104／ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，足夠數(shù)量的、但相對(duì)低密度的小孢子濃度有利于小孢子競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。第46頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（七）花藥壁因素

花藥組織的存在對(duì)小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用。但花藥壁損傷會(huì)釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。第47頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天單倍體植株鑒定和染色體加倍第48頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、倍性鑒定（為什么要進(jìn)行倍性鑒定？）1、染色體直接計(jì)數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀）主要測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長(zhǎng)，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。第49頁(yè),共54頁(yè)，2024