組織工程的研究與進展

組織工程的研究與進展

(ResearchandDevelopmentofTissueEngineering)1可編輯版

隨著移植醫(yī)學與替代醫(yī)療的發(fā)展，人體病損器官、器件和組織的替代物的臨床需求量迅

速增長。

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據(jù)美國國家健康統(tǒng)計中心（ＮＣＨＳ）調查，１９９３年不包括齒科材料，植入一件以上植入物的患者，在美國已達１１００萬人，占其總人口的４％，全球估計超過３０００萬人。

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齒科植入物，據(jù)日本齒科學會估計，廿一世紀初對牙種植體的需求量將達到其總人口的５０％。

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１９９７年美國ＦＡＤ預測未來十年生物醫(yī)學工程產(chǎn)業(yè)３９項新產(chǎn)品中涉及人體器官、器件和組織替代物的幾乎占５０％。

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由于源于人體的同種移植物來源有限，在美國僅不足２０％的患者能得到及時治療，耗資４００億美元。

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許多人工合成與制造的替代物，但在一定程度上能滿足臨床的要求，特別是在植入人體較長時間后，并發(fā)癥較多。因此，研制開發(fā)植入人體后能形成與人體結構組織相同、參與人體代謝、能夠修復和改善病損器官、器件和組織功能的植入物，是各國科學家孜孜以求的目標。

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組織工程（TissueEngineering)就是在這樣一些需求背景和人工器官技術、生物技術、生物材料技術等現(xiàn)代科學進展的基礎上發(fā)展起來的一項綜合性的高新技術，是跨世紀生物醫(yī)學工程前沿領域之一。

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１９８７年美國科學基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上提出組織工程這個名詞，１９８８年被定義為：“它應用工程科學與生命科學的原理與方法，在可控、可重復條件下，通過哺乳動物、人類（包括患者自己）的特定細胞在網(wǎng)絡構架的體外培養(yǎng)、體內植入增殖，形成具有特定功能組織和生物替代物?！?/p>

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第一個組織工程產(chǎn)品——人工皮膚于１９８８年２月經(jīng)ＦＤＡ批準其上市銷售，進入臨床實用階段。正在研究開發(fā)的骨骼、軟骨、血管以及神經(jīng)組織等項目也已進入進行體內實驗的階段。

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一、組織工程的基本原理

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許多文獻都將組織工程技術歸納為三個要素：種子細胞、基質材料與細胞生長因子。實際上除了上述三個要素以外，培養(yǎng)的生物環(huán)境也是重要的要素。

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１．種子細胞

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種子細胞指培養(yǎng)、存活、增殖最后形成組織的原始細胞。

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種子細胞可分為三類：異種、同種異體和自體細胞。

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性能穩(wěn)定、可重復提供的種子細胞來源是組織工程產(chǎn)品商業(yè)化的首要前提。

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動物細胞是存量充足的可靠細胞來源之一，但動物細胞在人體內會引起免疫排斥反應導致安全性的問題。

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采用轉基因等生物技術可使動物攜有人類的基因以減少甚至避免免疫排斥反應。但更嚴峻的問題是動物體內的一些病毒會導致人類的一些新的疾患的產(chǎn)生。

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有一些國家政府就明令禁止實施異種植入人體。實際上，對科學家來說重要的是要解決防止動物病毒傳染人類的問題，一旦異種細胞植入的安全性問題獲得解決，相信這些國家政府的禁令亦會逐步取消。但目前尚有較大的難度。

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目前在組織工程研究中人類自身的細胞仍然是種子細胞的主要來源。人類自身的細胞也存在不少問題。培養(yǎng)的人體組織細胞增生能力一般有限，同時在體外培養(yǎng)條件下隨著細胞的增殖會產(chǎn)生去分化現(xiàn)象，細胞喪失應有的功能。

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人類自身的原代細胞作為種子細胞的商業(yè)前景暗淡。但是，應強調在體內的條件下，有許多種成體細胞具有較強的“再生”能力。

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這同傳統(tǒng)的組織工程的研究思路不同，反而同傳統(tǒng)的人工器官的研究思路較接近。這就是近年發(fā)展的再生醫(yī)學發(fā)展的內容

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１９９８年末，美國有兩個研究機構先后成功地培養(yǎng)出人胚胎干細胞。與成體細胞不同，此類細胞具有持續(xù)生長，分化的能力，即從理論上講此類細胞在一定的條件下可以分化成人體的任何成體細胞，并具有成體細胞的功能。

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此類細胞是頗為理想的種子細胞來源。近年人胚胎干細胞的研究發(fā)展迅猛。隨著人胚胎干細胞研究的深入進行，也遇到了相當多的實踐問題，包括法律的與道德的問題。就技術而言仍有一些困難問題需要克服。

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人胚胎干細胞移植人體內后的致癌性問題、抗原性問題、如何調控人胚胎干細胞定向分化構建組織的目的細胞的問題等。

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目前比較接近于實際應用的種子細胞來源是從組織中分離出來的所謂“前驅細胞”，亦有稱之為組織干細胞。

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由于此類細胞在向特定分化方向轉化上已得到了部分調控，但它們尚未完全分化，因而尚存有足夠的靈活性以發(fā)育成幾種不同的類型的細胞。

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來源于中胚層細胞的間充質干細胞，它們存在于成人的骨髓中，在適當?shù)恼T導條件下具有多向分化為肌腱、骨、軟骨、脂肪、基質組織細胞的潛能，進而增殖培育成相應的組織。目前研究較多的此類細胞包括：造血干細胞系、神經(jīng)干細胞系以及間充質干細胞系等。

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２．基質材料

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基質材料類似于人體細胞外基質、作為種子細胞以及細胞生長因子的載體，使種子細胞賴以定向分化增殖發(fā)育成相應的組織?；|材料亦有稱為細胞支架。理想的基質材料起碼應具有以下一些性能：

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a.生物相容性

除了具有一般生物材料的生物相容性要求，還要求它利于種子細胞的粘附、分化與增殖。

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b.生物降解性

作為種子細胞的支架，一旦種細胞培育成組織，要求基質材料降解并為人體所代謝，即基質材料的降解速率與細胞生長的速率相適應，降解速率應可根據(jù)組織的生長特性加以調控。

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c.具有三維多孔立體網(wǎng)架結構

這種結構具有較高的比表面積和孔隙率，以利于種子細胞增殖、細胞外基質沉積進而形成組織。其中較高的空隙率，利于營養(yǎng)、氧氣的進入和代謝廢物的排出，有利于血管與神經(jīng)的長入。

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d.材料—細胞界面

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基質材料應提供優(yōu)異的材料——細胞界面，利于細胞的粘附、生長，更重要的是應能激活細胞特異基因的表達和維持正常細胞的表型表達。

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e.加工性能和機械強度

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由于病損和缺失的組織、器件、器官，形狀尺寸變化較大，有的基質材料甚至在手術植入時還需進一步加工，

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有的基質材料植入體內需為新生組織維持一段時間的力學支撐，直至新生組織具有足夠的力學特性為止。

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f.滅菌性能

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基質材料使用時均需滅菌。因此，要求滅菌過程對基質材料的基本性能不產(chǎn)生明顯的影響

和不帶來新的生物學危害作用。

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目前在組織工程中應用的基質材料主要有三大類別：天然材料及其復合物；合成高分子可降解材料及其復合物；無機材料及其復合物。

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a.天然材料

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目前應用較多的有膠原（以Ｉ型膠原為主）、明膠、甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、透明

質酸鈉等。

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此類材料制成的細胞支架生物相容性一般較好。其界面利于種子細胞的粘附、分化、增殖。問題是這類材料濕態(tài)強度差，較易為體液的各種酶所降解，降解速率過快。

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目前，大都采用交聯(lián)的方法來提高強度與減緩降解速率。也有采用天然材料之間的復合，

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b.合成可降解高分子材料

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目前應用較多的品種是聚乙交酯（ＰＧＡ）、聚丙交酯即聚乳酸（ＰＬＡ）、聚己內酯（ＰＣＬ）以及它們之間的各種共聚物。通過材料的組份、組成比、分子量、分子量分布等因素的調控來制備體內降解速率（半降解期）可以從幾周到幾年、其它性能也不盡相同、各有特長的基質材料。

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ＰＬＡ、ＰＧＡ及其共聚物在組織工程中采用的主要結構形式有纖維支架、多孔泡沫以及管狀結構等。

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纖維支架是由ＰＧＡ通過擠壓制成１０～１５μｍ的纖維，再通過編織加工技術形成編織加工技術形成編織狀或無紡狀結構，孔隙率可高達９７％，面積體積比高達０.０５μｍ-1

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１.這樣形成的支架一般不能承擔壓力。

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高度多孔的泡沫狀支架是一種較好的結構形式?？捎枚喾N方式獲得多孔泡沫結構，如：溶劑澆鑄、微粒溶出、氣體發(fā)泡、相分離等方法。其中氣體發(fā)泡法效果最好。

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ＰＬＡ和ＰＧＡ及其共聚物還可制成管狀結構用于尿道，小腸等管狀器官的基質材料。

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脂肪族聚酯類可降解高分子材料，作為基質材料尚有一些不足的方法，有待改進：

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（１）親水性差，細胞粘附、生長增殖受阻。如：ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ無紡纖維支架由于親水性差，細胞吸附力弱，滿足不了組織工程研究的要求。

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（２）引起無菌性炎癥。ＰＬＡ與ＰＧＡ在臨床應用中發(fā)現(xiàn)約有８％左右患者出現(xiàn)非特異性無菌性炎癥。平均分子量低于２萬時發(fā)病率增長，使用高分子量的ＰＬＡ只能遲緩而不能消除此種并發(fā)癥的發(fā)生。

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（３）抗壓強度差。大多數(shù)ＰＬＡ與ＰＧＡ無紡布支架均有抗壓強度差的問題。除了上述介紹的脂肪族聚酯可降解高分子材料及其復合物外，文獻中還報道采用聚偶磷氮（Polyphosphazenes）、聚原酸酯（Polyorthoesters,POE)、聚氨基酸（PolyaminoAcid)|bctisgxjrnpvsgxj(Polyesterurethane)等。

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與天然材料相比，合成的材料最大缺點是缺乏細胞識別信號，不利于細胞特異性粘附及特異基因的激活，許多學者致力于將一些識別信號片斷，引入合成基質材料表面與整體，以促進種子細胞的粘附、生長、增殖。

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c.生物陶瓷

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生物陶瓷指由金屬離子及非金屬離子以離子鍵結合的晶體材料。根據(jù)其在生理環(huán)境中的化學活性可分為四類：惰性生物陶瓷，表面活性生物陶瓷，可吸收性生物陶瓷與復合生物陶瓷。

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作為基質材料一般采用可生物降解的可吸收性生物陶恣。主要有以下一些品種：

60可編輯版（１）磷酸鈣陶瓷支架：磷酸

鈣陶瓷按其Ｃa/P比值分別為１.５、１.６７和２而分為磷酸三鈣、羥基磷灰石和磷酸四鈣，此外還有Ｃa/P比介于它們之間的物質，如：氟代及氧代的羥基磷灰石。其中以羥基磷灰石（ＨＡ）與β磷酸三鈣（β-ΤCΡ）研究最多。

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７０年代的研究認為骨骼中的無機成份主要是ＨＡ，因此認為ＨＡ植入人體內有利于骨組織的再生。

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近年的研究表明骨組織中的礦物質是Ｃa/P＜１．５的碳酸鹽磷灰石，除鈣、磷外尚含有鎂、鈉、鉀及一些微量元素。

63可編輯版

許多學者研究以β-ＴＣＰ為主的支架及其在組織工程中的應用取得一定的進展。由于磷酸鈣陶瓷表面的ξ電位效應、濕潤性及游離的磷酸根離子不利于細胞的粘附、增殖，這方面改進的研究尚待深入。

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（２）碳酸鈣陶瓷支架：天然珊瑚（主要成份為碳酸鈣）制成的細胞支架在９０年代初即被用于作為人類骨髓細胞、成纖維細胞、牙齦纖維細胞及胎鼠骨細胞的體外培養(yǎng)。實驗發(fā)現(xiàn)盡管培養(yǎng)早期人類細胞的貼壁率較低，但２０天后細胞數(shù)量和培養(yǎng)板一致，細胞的生理活性正常，分泌的骨唾蛋白，Ｉ型、ＩＩＩ型膠原、骨橋素均顯示陽性。細胞在支架上增殖持續(xù)時間長，碳酸鈣又是在體內可降解的材料。

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（３）生物活性玻璃細胞支架：含磷和鈣的硅玻璃（SiO-ＣａＯ-ＨＰＯ４）可以部分降解，其中一類特殊結構的稱為生物活性玻璃。其表面水解形成的水合層利于羥基磷灰石形成沉積，同時此類新生態(tài)的羥基磷灰石可選擇性吸附膠原、纖維粘連蛋白，從而使玻璃表面與骨及軟組織之間形成很好的生物相容界面，利于新骨形成。

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３.細胞生長因子

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生長因子（GrowthFactor,GF)是具有定向誘導和激活組織分化、增殖，維持細胞生物活性等生物效應的蛋白質類物質。它對于促進細胞增殖，以及組織的修復、再生具有重要的促進作用。

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生長因子的生理功能具有特異性和專一性，即每種生長因子只對某些細胞或某些細胞的某個分化階段發(fā)揮其生理功能。

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細胞生長因子并不能調控細胞分化的全過程。特別是利用生長因子來調控加快干細胞定向分化成目的細胞，利用一種生長因素，時常很難奏效。往往是若干種生長因子間協(xié)同作用方能調控向目的細胞的分化與增殖。

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生長因子的作用往往與細胞表面相應受體的活躍程度有關。如利用ＩＧＦ-Ｉ對肌腱細胞生長增殖的促進作用，其必要條件是ＩＧＦ-１受體系統(tǒng)的活躍。

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利用細胞因子來促進種子細胞的分化與增殖，雖是很有效的技術手段，但要成功地運用自如尚有相當多的問題需要研究加以解決。

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４.培養(yǎng)的生物環(huán)境

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目前許多研究者強調組織工程中細胞培養(yǎng)與擴增，應當是三維，因此推崇采用微重力效應下，細胞與組織三維培養(yǎng)技術。

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我們應當看到人體的細胞的種類是非常多的，不同組織與器官所在的生理環(huán)境（包括力學環(huán)境）千差萬別。因此，在某些特定環(huán)境中應用的組織只有在特定的環(huán)境條件下培養(yǎng)才能符合臨床應用的要求。

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因此，研究組織工程中細胞培養(yǎng)與擴增條件時，應當重視在與人體生理環(huán)境類似條件下的培養(yǎng)。特別是人體的許多組織的再生能力很強：如人的膀胱，研究在人體環(huán)境下膀胱的再生無疑是非常有科學價值的研究方向。

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二、組織工程一些活躍的研究領域

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組織工程的目標旨在研制、開發(fā)能夠修復損傷或缺失組織功能的體內植入物。因此，組織工程的一些活躍的研究多集中在能夠較快地在臨床應用、可形成商品化、應用前景較明確的一些領域。

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１.骨組織工程

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將基質材料與生長因子（主要是骨形成蛋白rhBMP-２和人轉移生長因子βｒｈＴＧＦ-β。在體外組裝后植入體內，通過生長因子分子誘導成骨細胞分化、增殖進而長成新骨。這對于小區(qū)域骨缺損的修復有較好的療效。

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另一種思路，利用體外細胞培養(yǎng)技術增殖獲得足夠數(shù)量的成骨細胞，然后與基質材料在體外組裝后植入缺損部位。目前，正在利用后一種思路研究長骨的體內生物植入物。

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ＢＭＰ在人體內發(fā)揮作用的時間受到限制，有的學者提出將控制ＢＭＰ合成的ＤＮＡ質粒復合于基質材料中植入人體，這樣可以在骨組織形成過程中不斷合成ＢＭＰ，促進成骨細胞生長。

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２．皮膚組織工程

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最早的皮膚生物替代物是源于患者本人的角質細胞在高鈣條件下的復層模片，爾后將其用酶從培養(yǎng)瓶中消化下來，移植至斷層或全層皮膚創(chuàng)面。

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之后，較成功的實驗是將新生兒包皮中成纖維細胞與牛Ｉ型膠原制成真皮替代物。表面由自體表皮細胞覆蓋，成功地用于人體創(chuàng)面復蓋。

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近年，由膠原與硫酸軟骨素復

合的模擬真皮；ＰＧＡ和ＰＬＡ作支架移植新生兒包皮成纖維細胞增殖后制成的人工真皮；去除包含有郎罕氏細胞的表皮成份，經(jīng)過一段時間冷藏的無細胞異體真皮等產(chǎn)品均在燒傷創(chuàng)面應用獲得成功。

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人工皮膚是最早被ＦＤＡ批準上市的組織工程產(chǎn)品。

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皮膚生物工程產(chǎn)品的設計已趨成熟，即此種皮膚替代物應用表皮、真皮兩層，表皮中的細胞應具有分化、增殖的能力，表皮與真皮之間的緊密粘附，通過兩層細胞間的相互作用實現(xiàn)人工組織植入物的功能。

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３．肌腱、軟骨組織工程

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結締組織的替代是重建外科的熱點，其中尤以肌腱與軟骨修復受到關注。

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ＰＧＡ與間充質細胞構成的人工組織植入裸鼠皮下、兔子的關節(jié)缺損進行了廣泛的研究，證明可以形成軟骨，肌腱和新生骨。還可以進行血管化再生組織的培養(yǎng)。

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軟骨的體外培養(yǎng)已獲成功，關鍵是要得到足夠的厚度與相應的強度。體外培養(yǎng)中新生軟骨超過一定的厚度，中心區(qū)域的軟骨細胞由于距離邊緣遠而無法得到充足的營養(yǎng)和氧氣，無法對各種生長因子的刺激作出響應，也不能排除代謝廢物。國外采用一種旋轉式生物反應器，在此反應器的細胞支架上進行培養(yǎng)，保證細胞營養(yǎng)與氧氣充足供應與代謝廢物的排除，同時對環(huán)境施以一定的應力場作用，導致組織工程化軟骨，富含膠原及其他一些蛋白質。

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肌腱組織工程的種子細胞目前大多采用胚胎肌腱組織分離、純化獲得的肌腱細胞。采用以膠原為主原料制成的天然細胞支架，也有采用ＰＬＡ與ＰＧＡ細胞支架的，后者親水性較差而影響細胞粘附。

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肌腱組織工程中還有一個極其重要的研究方向就是利用支架植入誘導自體肌腱組織的再生。文獻中已有成功的報道。

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４．具有分泌功能器官的組織工程

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實驗中的研究目標目前集中在人工肝、人工胰及人工腎。以人工肝為例，實際上目前還沒有到達形成肝組織的水平，只是分化增殖肝細胞的聚集體。另一片目前有二類研究方向。一類是體內型，主要是利用海藻酸／聚賴氨酸包埋肝細胞形成生物微膠囊用作組織細胞移植治療的免疫隔離工具，組織在囊內分化、增殖，營養(yǎng)和氧份由組織液提供，細胞的分泌物與代謝由囊內向囊外輸運再轉運全身，起到肝組織的分泌代謝功能。

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另一類是體外型。主要是利用空心纖維型生物反應器在體外大量培養(yǎng)肝細胞，該反應器附有供營養(yǎng)液、充氣和排泄裝置，使細胞維持在良好的微環(huán)境中生長。利用血液凈化的原理經(jīng)肝細胞作用后的血液回輸體內。此類裝置實際上只是肝臟的短期支持系統(tǒng)。

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生物活性的人工胰，也是利用微膠囊技術包埋胰島細胞制成。植入腹腔后胰島細胞分泌的胰島素通過微囊半透膜輸運到腹腔，爾后通過血液循環(huán)轉運到全身。

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三、組織工程研究的若干問題

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１．人體組織與器官的替代需要“綜合”各學科的成就各個學科總是從本學科已有的技術優(yōu)勢出發(fā)來解決臨床遇到的一些科學“難題”。從某種意義上講，這種優(yōu)勢又是一種片面。

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只有不受狹小學科的思維束縛，在多領域的技術成就的基礎上，集成各方面的技術優(yōu)勢，才有可能解決人體器官的替代、修復、再生、復制與置換這樣一個極其復雜的問題。

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２．免疫問題

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由于人