組織制片技術(shù)概述課件

組織制片技術(shù)1可編輯版

組織制片技術(shù)的概述組織制片技術(shù)的方法組織制片技術(shù)的基本程序蘇木精—伊紅染色2可編輯版

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

從16世紀(jì)60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開(kāi)始觀察和描述軟木塞中的細(xì)胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學(xué)的發(fā)展而不斷進(jìn)步。3可編輯版4可編輯版5可編輯版6可編輯版7可編輯版8可編輯版

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

在19世紀(jì)中期，隨著生物、物理和化學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機(jī)的逐步完善，組織學(xué)也建立起一整套完整科學(xué)的組織制片技術(shù)。9可編輯版

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

特別是20世紀(jì)50年代以來(lái)，由于組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。10可編輯版11可編輯版12可編輯版

利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標(biāo)本，顯示了組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細(xì)胞之間的相互連接及組織細(xì)胞中的某些化學(xué)成分的種類(lèi)和含量。提供最直觀的依據(jù)。組織制片是研究醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)最基本的手段。組織制片的意義和目的13可編輯版組織制片技術(shù)的方法

非組織切片法組織切片法14可編輯版非組織切片法組織不經(jīng)過(guò)切片制成觀察標(biāo)本的方法。非組織切片法的種類(lèi)涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標(biāo)本、活體標(biāo)本、整裝標(biāo)本、血管注射標(biāo)本。15可編輯版涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細(xì)胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。16可編輯版壓片

先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學(xué)藥品進(jìn)行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運(yùn)動(dòng)終板和寄生蟲(chóng)標(biāo)本等。17可編輯版鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過(guò)固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。18可編輯版磨片：對(duì)于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進(jìn)行染色封固在載玻片上。19可編輯版消化分離標(biāo)本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)將細(xì)胞間質(zhì)消化溶解，再用機(jī)械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個(gè)而又完整的細(xì)胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進(jìn)行封固。例如平滑肌分離標(biāo)本，脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞等。20可編輯版

活體標(biāo)本將所采的觀察標(biāo)本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。21可編輯版整裝標(biāo)本

①將胚胎或小動(dòng)物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿(mǎn)固定劑的透明容器中

。②將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標(biāo)本。22可編輯版血管注射標(biāo)本

①將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管，用酸或鹼將血管周?chē)慕M織腐蝕后做成的整體封藏的血管標(biāo)本。②將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標(biāo)本。23可編輯版組織切片法

利用化學(xué)試劑將組織經(jīng)過(guò)一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進(jìn)組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機(jī)將包埋好的組織塊切成以微米計(jì)的薄片，再根據(jù)需要進(jìn)行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標(biāo)本的方法。

24可編輯版組織切片法的種類(lèi)

冰凍切片石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片25可編輯版

冰凍切片將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類(lèi)或某些酶類(lèi)的活性。為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織，也可用這種方法。

26可編輯版組織切片標(biāo)本制作的基本程序:

1.取材→2.固定和固定后處理→

3.脫水→4.透明→

5.浸蠟與包埋→

6.切片→

7.染色→

8.封固

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取材一、動(dòng)物的處死手法迅速、快捷。

常用方法：

1.麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。

2.空氣栓塞法：耳靜脈，20－30ml空氣

3.擊頭法：重物猛擊，迅速致死。

4.頸椎脫臼法：小白鼠

5.破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙

6.股動(dòng)脈放血：麻醉后放血使大動(dòng)物迅速死亡。28可編輯版29可編輯版二、取材的步驟

選擇動(dòng)物選擇取材部位選擇切面方向

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應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作的目的和經(jīng)濟(jì)能力選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

肝臟—豬肝卵巢—貓胃—狗運(yùn)動(dòng)終板—爬蟲(chóng)類(lèi)動(dòng)物肥大細(xì)胞—大、小白鼠的皮下組織間皮和內(nèi)皮—蛙的腸系膜31可編輯版

根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材部位

胰腺—胰尾部脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元—頸膨大和腰膨大處肺—肺門(mén)胃—胃底部

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根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材時(shí)切面的方向腎臟—腎門(mén)處作縱切33可編輯版頭皮—順毛根的方向縱切34可編輯版大小腸的環(huán)行皺襞—縱切35可編輯版氣管和食管—橫切36可編輯版三、取材時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：

組織新鮮：取材動(dòng)作快捷，迅速投入固定液注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定材料應(yīng)小而?。翰怀^(guò)1.5×1.5×0.5cm3

固定液會(huì)造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài)取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染37可編輯版固定和固定后處理一、固定的目的：

固定劑使細(xì)胞的成分凝固，防止組織細(xì)胞自溶和腐敗，保持細(xì)胞生活時(shí)的狀態(tài)。固定劑的酶染作用使細(xì)胞各成分易于被染料著色。使組織適度硬化，利于制作薄片。38可編輯版二、固定的方法：

1.直接固定：最常用。

2.蒸汽固定：1－2％鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。

3.灌注固定：（必須進(jìn)行后固定）

局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)39可編輯版三、固定的注意事項(xiàng)：

固定劑的用量一般為組織塊體積的15倍左右固定劑的配制現(xiàn)配現(xiàn)用固定的時(shí)間受較多因素的影響。一般過(guò)夜或者24小時(shí)可達(dá)到固定要求。40可編輯版四、常用固定劑單純固定劑

甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重鉻酸鉀、丙酮、鉻酸、四氧化鋨

固定組織時(shí)，只單用某一種試劑尚難對(duì)各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對(duì)組織的作用與反應(yīng)，配成混合固定劑，以求得補(bǔ)償某試劑對(duì)組織所致的缺陷?；旌瞎潭▌?/p>

中性甲醛液、乙醇—甲醛液、Bouin氏液、苦味酸—硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液41可編輯版甲醛(Formeldedhyde)固定濃度：4%甲醛溶液固定時(shí)間：12小時(shí)—24小時(shí)固定后處理：流水沖洗12小時(shí)—24小時(shí)配制方法：甲醛10ml+生理鹽水/蒸溜水90ml特性：甲醛放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿?，使溶液變?yōu)樗嵝?，?yán)重時(shí)可影響到細(xì)胞核著色（＜）。42可編輯版乙醇(Ethylalcohol)固定濃度：80%--90%乙醇液固定時(shí)間：一般4小時(shí)—12小時(shí)固定后處理：直接入脫水劑配制方法：無(wú)水乙醇+蒸餾水特性：乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類(lèi)脂體、色素等，注意制片的目的（＜）

。43可編輯版中性甲醛液配制方法：

40%甲醛120ml蒸餾水880ml

磷酸二氫鈉4g磷酸氫二鈉13g固定時(shí)間：24小時(shí)固定后處理：流水沖洗24小時(shí)適用組織：常用固定劑，適用廣泛（＜）44可編輯版乙醇—甲醛液（A—F液）配制方法：95%乙醇90ml40%甲醛10ml

固定時(shí)間：組織塊固定4—12小時(shí)，鋪片固定5—10分鐘。固定后處理：直接入脫水劑。適用組織：肥大細(xì)胞，糖原的固定（＜）

。45可編輯版Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml40%甲醛25ml

冰乙酸5ml固定時(shí)間：12—24h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。46可編輯版五、固定后處理

除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱(chēng)為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗

：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過(guò)流水沖洗24h。酒精脫黃:含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過(guò)70％乙醇洗滌脫去黃色。47可編輯版碘酒脫汞

：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素

：甲醛長(zhǎng)期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶，70％乙醇－濃氨水溶液除去。組織漂白：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。48可編輯版脫水一、定義用某種能與透明劑互溶的化學(xué)試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來(lái)的過(guò)程。要點(diǎn)：緩慢、徹底、勿過(guò)度。二、常用脫水劑

乙醇、丙酮、正丁醇49可編輯版乙醇固定劑+脫水劑上行酒精脫水70%（30%）→100%，以10％遞增。丙酮脫水強(qiáng)，但對(duì)組織的收縮脆化作用也強(qiáng)；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護(hù)某些特殊染色的標(biāo)本不被褪色。50可編輯版透明一、定義對(duì)組織的最后脫水處理。在經(jīng)過(guò)前一階段的“脫水”后，還要借某種有機(jī)溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑

二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷、冬青油51可編輯版二甲苯

為無(wú)色透明的液體，易揮發(fā)，長(zhǎng)期接觸對(duì)呼吸道粘膜有較強(qiáng)的刺激作用20分鐘—1個(gè)小時(shí)，大塊組織可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。作用迅速，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易發(fā)生過(guò)度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無(wú)色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時(shí)間12--24小時(shí)。對(duì)組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明52可編輯版

用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過(guò)程包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過(guò)程稱(chēng)為浸蠟。組織塊浸蠟一般先經(jīng)過(guò)低熔點(diǎn)蠟，再經(jīng)過(guò)高熔點(diǎn)蠟。

包埋

53可編輯版高溶點(diǎn)蠟也稱(chēng)硬蠟溶點(diǎn)在60℃--62℃硬蠟箱的溫度控制在62℃--64℃之間組織浸蠟時(shí)間一般不超過(guò)1小時(shí)

低溶點(diǎn)蠟也稱(chēng)軟蠟溶點(diǎn)在48℃--50℃

軟蠟箱的溫度控制在52℃—54℃之間組織浸蠟時(shí)間一般可達(dá)2—4小時(shí)54可編輯版二、包埋組織浸蠟完成后，接著進(jìn)行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。修整蠟塊時(shí)，組織塊應(yīng)距蠟塊邊緣2—3毫米，以利于連續(xù)切片。

55可編輯版切片

石蠟切片組織切片中應(yīng)用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄的組織標(biāo)本，而且包埋塊可長(zhǎng)期保存。56可編輯版一、儀器及器材57可編輯版二、切片過(guò)程：

調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47℃左右；固定蠟塊于固定器；快修裝置修整包埋面；調(diào)節(jié)切片厚度至4—6微米；連續(xù)切片；攤片于水箱內(nèi)；將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上；置于溫箱內(nèi)烤片。58可編輯版三、切片的注意事項(xiàng)

①切片前要將切片機(jī)各部位的螺絲旋緊，否則會(huì)引起切片機(jī)各部件震動(dòng)，造成切片厚薄不勻。②包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應(yīng)按切片機(jī)刀臺(tái)上的刻度作適當(dāng)調(diào)整。③恒溫水箱的溫度應(yīng)比包埋蠟的溶點(diǎn)低5℃--6℃。59可編輯版染色

一、染料

指分子中含有發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的有機(jī)化合物，有鮮艷的色彩，對(duì)于組織有極強(qiáng)的親和力。根據(jù)來(lái)源可分為兩類(lèi)：天然染料（卡紅、蘇木精）人工合成染料（苦味酸、桔黃G）根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)分為：堿性染料(basicdye)

酸性染料(aciddye)

中性(neutrophilia)染料60可編輯版二、染色的原理

染色就是染料和組織細(xì)胞的分子相互結(jié)合，使組織和細(xì)胞著色?；瘜W(xué)反應(yīng)在組織細(xì)胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時(shí)酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細(xì)胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強(qiáng)的親和力。細(xì)胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強(qiáng)的親和力。能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)；能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸性(acidophilia)。61可編輯版物理反應(yīng)細(xì)胞中有許多微小的毛細(xì)小孔，染料的色素離子通過(guò)這些小孔滲入細(xì)胞內(nèi)，染料與細(xì)胞沒(méi)有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細(xì)胞分子之間通過(guò)分子間相互作用使細(xì)胞著色。62可編輯版三、染色的注意事項(xiàng)：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長(zhǎng)時(shí)間。3.溫度：高，染色效果明顯。4.適當(dāng)使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，其本身與染料或組織發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時(shí)添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，本身并不參與染色反應(yīng)。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過(guò)染的染色液，使染色部位與周?chē)M織對(duì)比鮮明，著色深淺適當(dāng)；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。63可編輯版封固一、定義最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機(jī)械磨損等，延長(zhǎng)切片的使用時(shí)間。這一步驟稱(chēng)為封固。