醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座

第五次試驗課內(nèi)容1、細菌代謝產(chǎn)物檢驗，數(shù)碼判定（示教）2、腸道桿菌在選擇判別培養(yǎng)基生長情況（示教）

EMB、SS平板、雙糖鐵培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基3、肥達試驗（結(jié)果示教）4、肉湯增菌結(jié)果血平板接種（操作，每組一份）5、病例二討論醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第1頁原理：染色鏡檢普通瓊脂平板中菌落形態(tài)不能判別能夠判別試驗一細菌代謝產(chǎn)物檢驗，數(shù)碼判定細菌代謝產(chǎn)物分解代謝產(chǎn)物合成代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)?醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第2頁細菌菌落色素觀察金黃色葡萄球菌：產(chǎn)生只局限于菌落脂溶性金黃色色素。銅綠假單胞菌：產(chǎn)生帶熒光水溶性色素，該色素可擴散至菌落周圍，使培養(yǎng)基呈亮綠色。金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第3頁細菌菌落溶血現(xiàn)象觀察乙型溶血性鏈球菌:透明無色溶血環(huán)。SLOorSLS？醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第4頁一、糖發(fā)酵試驗原理：不一樣細菌分解糖類能力和分解代謝產(chǎn)物不一樣應(yīng)用：慣用于腸道細菌判定醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第5頁結(jié)果判定培養(yǎng)基變紅色陽性，記為+

培養(yǎng)基變紅色，試管內(nèi)有氣泡陽性，記為+

指示劑不變色陰性，記為-葡萄糖乳糖傷寒沙門菌糖發(fā)酵試驗大腸埃希菌糖發(fā)酵試驗痢疾志賀菌糖發(fā)酵試驗副傷寒沙門菌糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第6頁IMViC是吲哚（indole）、甲基紅（methylredtest）、V-P（Voges-Prokauertest）和枸櫞酸鹽利用（citratetest）四個試驗縮寫，用于快速判別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌（衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗）細菌代謝產(chǎn)物檢驗，數(shù)碼判定醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第7頁二、靛基質(zhì)（吲哚）產(chǎn)生試驗(I)原理：分解蛋白胨內(nèi)色氨酸形成靛基質(zhì)（無色）靛基質(zhì)與靛基質(zhì)試劑中對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合而顯紅色(玫瑰吲哚)材料：蛋白胨水培養(yǎng)基（氯化鈉、蛋白胨、蒸餾水）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第8頁方法：約0.3ml靛基質(zhì)試劑漸漸加入細菌蛋白胨水培養(yǎng)物注：加入吲哚試劑后切勿搖擺結(jié)果：大腸埃希菌(﹢)紅色產(chǎn)氣桿菌(﹣)黃色紅色吲哚大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第9頁葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸pH<4.5甲基紅指示劑培養(yǎng)基呈紅色（+）乙酰甲基甲醇（中性）pH>5.4培養(yǎng)基呈橘黃色（-）脫羧大腸埃希菌和產(chǎn)氣桿菌都能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣……產(chǎn)氣桿菌能使丙酮酸脫羧大腸桿菌三、甲基紅試驗（M）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第10頁材料：葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、蒸餾水）方法：結(jié)果：大腸埃希菌，紅色——＋產(chǎn)氣桿菌，黃色——

－醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第11頁葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸乙酰甲基甲醇紅色化合物（+）脫羧四、VP試驗（Vi）大腸埃希菌和產(chǎn)氣桿菌都能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣……產(chǎn)氣桿菌能使丙酮酸脫羧大腸桿菌在堿性溶液中被氧化VP試劑（李氏試劑）不能反應(yīng)（-）反應(yīng)30min二乙酰+精氨酸胍基醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第12頁材料：葡萄糖蛋白胨水李氏試劑（硫酸銅、濃氨水、NaOH、蒸餾水）方法：暴露于空氣中結(jié)果:大腸埃希菌，不出現(xiàn)紅色（﹣）產(chǎn)氣桿菌，紅色（﹢）大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第13頁五、枸櫞酸鹽利用試驗（C）枸櫞酸鹽銨鹽碳酸鹽氨培養(yǎng)基pH下降溴麝香草酚藍呈堿性變色培養(yǎng)基變藍培養(yǎng)基產(chǎn)氣桿菌能利用銨鹽作為唯一氮源，利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第14頁材料：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（枸櫞酸鈉、NH4H2PO4、MgSO4、K2HPO4、NaCl、瓊脂、蒸餾水、0.5%溴麝香草酚蘭酒精溶液）方法：結(jié)果：大腸埃希菌，綠色（﹣）產(chǎn)氣桿菌，深藍色（﹢）產(chǎn)氣桿菌大腸桿菌有沒有菌落？醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第15頁用于腸桿菌科屬間判別大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌

IMViC試驗總結(jié)醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第16頁

分解六、硫化氫產(chǎn)生試驗原理：材料：醋酸鉛培養(yǎng)基（普通瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鈉溶液、醋酸鉛溶液）含硫氨基酸硫化氫遇鉛鹽或亞鐵鹽黑褐色沉淀醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第17頁方法：結(jié)果：變形桿菌，黑褐色——＋大腸埃希菌，不變色——－

變形桿菌大腸桿菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第18頁對蛋白質(zhì)發(fā)酵吲哚試驗硫化氫試驗對糖發(fā)酵糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗VP試驗其它枸櫞酸鹽利用試驗醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第19頁

試驗原理該試劑條是由20個含干燥底物小管所組成，用細菌懸浮液接種。培養(yǎng)一定時間后，經(jīng)過代謝作用產(chǎn)生顏色改變，或在培養(yǎng)后加入試劑后變色而觀察結(jié)果。腸道桿菌數(shù)碼判定（API20E）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第20頁判讀結(jié)果：每三項為一組，每組分值為124分）將陽性反應(yīng)分值相加，得出數(shù)據(jù)編碼，從API20E編碼手冊中查細菌名稱。

數(shù)碼判定（API20E）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第21頁（21）半固體培養(yǎng)基(動力試驗)

大腸埃希菌

志賀菌傷寒沙門菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第22頁材料：1、EMB培養(yǎng)基、SS瓊脂平板、雙糖鐵培養(yǎng)基2、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、志賀菌選擇培養(yǎng)基腸道桿菌在選擇判別培養(yǎng)基生長情況判別培養(yǎng)基醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第23頁

伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB）EMB平板基質(zhì)肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基抑制物伊紅、美藍底物乳糖指示劑伊紅、美藍堿性無色半透明菌落酸性→紫黑色或紫紅色，且有金屬光澤菌落持點＋為紫黑色或紫紅色菌落－為無色半透明菌落抑制作用抑制G＋菌用途分離沙門菌和志賀菌屬弱選擇培養(yǎng)基醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第24頁原理：（EMB平板)非致病菌：致病菌：美藍

分解乳糖伊紅結(jié)合紫黑色或紫紅色化合物不分解乳糖，菌落呈無色、半透明。其它類似培養(yǎng)基？醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第25頁SS培養(yǎng)基（SalmonellaShigellaAgarMedium）SS平板基質(zhì)肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基抑制物膽鹽、煌綠、枸櫞酸鈉、硫代硫酸鈉底物乳糖指示劑中性紅pH（6.8—8.0）堿性→黃色酸性→紅色菌落持點＋為粉紅色菌落－為無色半透明菌落抑制作用抑制大腸桿菌及G＋菌用途分離沙門菌和志賀菌屬強選擇培養(yǎng)基醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第26頁原理：（SS平板）非致病菌：致病菌：膽鹽

分解乳糖乳酸膽酸中心渾濁粉紅色菌落不分解乳糖，菌落呈透明無色；枸櫞酸鐵能指示硫化氫產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色注意：非致病菌并非被殺滅，故挑病原菌菌落時，盡可能挑取菌落中心部分醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第27頁大腸埃希菌痢疾志賀菌大腸埃希菌與傷寒沙門菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第28頁雙糖鐵培養(yǎng)基（DoublesugarIronMedium）成份含酚紅指示劑pH7.6蛋白胨水500mL

瓊脂(1.3%)6.5g

乳糖(1%)5g葡萄糖(0.1%)0.5g

硫酸亞鐵銨(0.02%)0.1g

硫代硫酸鈉(0.02%)0.1g用途

初步判別腸道桿菌醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第29頁原理：只分解葡萄糖：產(chǎn)少許酸上層培養(yǎng)基酸+O2→CO2+H2O蛋白胨代謝產(chǎn)物下層培養(yǎng)基不接觸空氣→培養(yǎng)基呈酸性→顯黃色葡萄糖、乳糖都分解硫酸亞鐵銨：用以檢驗細菌分解蛋白質(zhì)后是否產(chǎn)生硫化氫。只產(chǎn)酸產(chǎn)酸&產(chǎn)氣培養(yǎng)基略變堿指示劑變紅醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第30頁

腸道桿菌生長結(jié)果

SSEMB雙糖鐵大腸埃希菌粉紅色大菌落紫黑色或紫紅色黃色痢疾志賀菌無色細小無色、半透明上紅下黃半透明菌落傷寒沙門菌無色細小無色、半透明上紅下黃半透明菌落黑色沉淀醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第31頁特異性抗體（血清中）診療菌液肉眼可見凝集現(xiàn)象檢測試劑成份病人體內(nèi)反應(yīng)傷寒或副傷寒病人O抗原H抗原含有傷寒沙門菌O抗原傷寒沙門菌H抗原甲型副傷寒沙門菌H抗原肖氏沙門菌H抗原肥達試驗（Widaltest）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第32頁方法：1、每孔加0.5mlN.S2、倍比稀釋病人血清，第7孔不加做對照3、每孔加0.5ml抗原4、輕輕振蕩混勻后，37℃孵育過夜醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第33頁結(jié)果觀察++++清澈透明，菌體形成凝塊于管底

+++較透明，大部分菌體形成凝塊于管底

++稍渾濁，較多細小凝集

+較渾濁，有細小凝集－渾濁，無凝集血清凝集效價：(抗體滴度)

與定量Ag產(chǎn)生顯著凝集（++）血清最高稀釋倍數(shù)醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第34頁結(jié)果分析（1）

傷寒沙門菌“O”效價≥1：80“H”效價≥1：160

副傷寒沙門菌“H”效價≥1：80◆O、H效價＞正常值，腸熱癥可能性大＜正常值，可能性小◆O高H不高：感染早期or交叉反應(yīng)◆O不高H高：預(yù)防接種、非特異性回想反應(yīng)有診療價值醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第35頁O抗原沙門菌屬間有交叉反應(yīng)IgMH抗原種特異性--傷寒沙門菌IgG甲型副傷寒沙門菌肖氏沙門菌希氏沙門菌結(jié)果分析（2）醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第36頁肉湯增菌結(jié)果血平板接種1、觀察肉湯增菌結(jié)果2、接種視細菌培養(yǎng)條件而用不一樣平板血標本肉湯增菌血平板分離培養(yǎng)革蘭染色血漿凝固酶+觸酶試驗病例1醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第37頁病例二患者：男性，19歲。惡心、腹痛4h，伴水樣腹瀉3次入院就診。無嘔吐、寒顫。腹痛呈陣發(fā)性。既往體檢無過敏史。體檢：T38.5℃，BP134/75mmHg，P100次/分，R16次/分。心肺正常。上腹壓痛，而無反跳痛。肝脾未觸及。試驗室檢驗：糞便鏡檢可見中性粒細胞，偶見紅細胞。血象正常。尿正常。問題：1．該患者可能患了什么疾病？需與哪些疾病作判別診療？2．怎樣進行微生物學(xué)檢驗？

醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第38頁1、病例分析：感染中毒引發(fā)腹痛和腹瀉可能原因有哪些？腫瘤食物過敏炎癥性腸病潰瘍腹外疾病腸易激綜合征醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第39頁主訴：陣發(fā)性腹痛、腹瀉腸道感染細菌病毒寄生蟲真菌?腸桿菌科：大腸埃希菌、志賀菌屬、沙門菌屬弧菌科：霍亂菌、副溶血性弧菌彎曲菌屬：空腸彎曲菌球菌科：金黃色葡萄球菌等輪狀病毒、Norwork病毒和腸腺病毒等溶組織阿米巴、藍氏賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲等念珠菌、曲菌、毛霉菌等醫(yī)學(xué)微生物實驗專家講座第4