免疫學方法及其應(yīng)用

關(guān)于免疫學方法及其應(yīng)用病原微生物感染機體對抗免疫幾個基本概念免疫(immunity)：是人和動物機體的一種保護性反應(yīng)，其作用是“識別”和排除抗原性“異物”，以維持機體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學：研究機體自我識別和對抗原性異物排斥反應(yīng)的一門科學。傳統(tǒng)的免疫概念：機體抵抗病原微生物的能力，即抗傳染免疫1.免疫和免疫學第2頁,共70頁，2024年2月25日，星期天幾個基本概念2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：具有自身的運行機制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機體在生命過程中總的生理平衡。免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅“異己”“異己”來自兩個方面:外來的入侵者：侵入身體的各種致病菌包括哪些？(2)“變壞了的”自身細胞。細胞癌變第3頁,共70頁，2024年2月25日，星期天免疫系統(tǒng)的生理功能①免疫防御——機體排斥外源性抗原異物的能力。②免疫自穩(wěn)——機體識別和清除自身衰老殘損的組織、細胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。③免疫監(jiān)視——機體殺傷和清除異常突變細胞，機體監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。第4頁,共70頁，2024年2月25日，星期天(1)探針帶來細菌入侵(2)吞噬細胞趕赴“現(xiàn)場”(3)消滅入侵恢復健康第5頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

4.機體防御機制人體第一道防線———天然免疫(非特異性免疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細胞和免疫分子組成。人體第二道防線———獲得性免疫(特異性免疫)分類：體液免疫細胞免疫第6頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系◆在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。第7頁,共70頁，2024年2月25日，星期天吞噬細胞的吞噬和殺菌過程示意圖第8頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用第一節(jié)抗原與抗體

一、抗原二、抗體第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用

免疫學及其試驗技術(shù)對食品安全檢測具有重要意義！第9頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)抗原與抗體

一、抗原(antigen)

包括兩個基本內(nèi)容：（1）免疫原性：抗原刺激有機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的能力；（2）反應(yīng)原性：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；抗原性：免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱。

定義：凡是能刺激有機體(人或動物體)產(chǎn)生抗體，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。第10頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原1、抗原的基本性質(zhì)（1）異物性（2）大分子量（3）特異性

抗原刺激機體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。

特異性是由抗原表面的抗原決定基(簇)決定的。

抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或具有化學活性的基團?？乖瓫Q定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4）化學結(jié)構(gòu)復雜

免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學結(jié)構(gòu)復雜。極性基團愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強。

第一節(jié)抗原與抗體

第11頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原2、抗原的種類按抗原性的完整與否及其在機體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點，可分為完全抗原和不完全抗原。（1）完全抗原與不完全抗原①完全抗原既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機體產(chǎn)生抗體，并與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外(試管內(nèi))發(fā)生反應(yīng)的抗原。

如細菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、②不完全抗原（半抗原）只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性。即不能單獨刺激機體產(chǎn)生抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復合物成為完全抗原，則可刺激機體產(chǎn)生抗體。

如各種低分子量的藥物、脂類和多糖等都屬于不完全抗原。第一節(jié)抗原與抗體

第12頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（2）細菌抗原第13頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原①菌體抗原（O抗原）在細胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O抗原的組成不同進行分群。O抗原耐熱，121℃，2h不被破壞。如沙門氏菌屬的O抗原不同分成67個血清群。

②鞭毛抗原（H抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。H抗原不耐熱，56～80℃，30～40min即被破壞。在制備O抗原時常用煮沸法消除H抗原。2、抗原的種類（2）細菌抗原第一節(jié)抗原與抗體

第14頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原③表面抗原（表面抗原）包圍在細菌細胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱。如肺炎鏈球菌——莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌——包膜抗原或K抗原，沙門氏菌屬——Vi抗原等。④菌毛抗原

存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。⑤外毒素和類毒素

細菌外毒素具有很強的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)0.3%～0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類毒素。2、抗原的種類（2）細菌抗原第一節(jié)抗原與抗體

第15頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體(antibody,Ab)定義：抗原刺激有機體(人或動物)所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白?？贵w是由B細胞識別抗原后增殖分化為漿細胞所產(chǎn)生的一類糖蛋白，能與相應(yīng)抗原表位結(jié)合，是介導體液免疫的重要免疫分子。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)：將具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。分泌型(secretedIg,sIg)：膜型(membraneIg,mlg)：在血清和組織液中，占全部機體血清的20%～25%。具有抗體的各種免疫功能是B細胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱為免疫血清或抗血清。第一節(jié)抗原與抗體

第16頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體1、抗體的性質(zhì)（1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血清中提取抗體球蛋白。（2）在體外(試管內(nèi))，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合并出現(xiàn)可見反應(yīng)；在體內(nèi)，與其他防御機能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起到抗感染作用。但某些抗體在機體內(nèi)與相應(yīng)的抗原相遇時，能引起變態(tài)反應(yīng)。如青霉素過敏等。第一節(jié)抗原與抗體

第17頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體（3）由不同細胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的多樣性。

例如將血清電泳時，免疫球蛋白主要分布于γ球蛋白區(qū)，因而曾稱抗體為γ球蛋白，也有少量延伸到β區(qū)和α2區(qū)。每一個Y字形的Ig單體分子能結(jié)合2個抗原表位，稱之為兩價；分泌型IgA為4價；五聚體IgM理論上為10價，但由于立體構(gòu)型的空間阻位，一般只能結(jié)合5個抗原表位?？贵w作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此,抗體即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白抗體(或稱抗抗體)，用于熒光抗體技術(shù)中(間接法)。1、抗體的性質(zhì)第一節(jié)抗原與抗體

第18頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體2、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈(H鏈)兩條輕鏈(H鏈)440個氨基酸殘基組成，分子量約50～70kD220個氨基酸組成，分子量約22.5kD。二硫鍵(-S·S-)根據(jù)VH/VL氨基酸順序同源程度的差異，可將Ig分為類和亞類。人的免疫球蛋白共5類：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE第一節(jié)抗原與抗體

第19頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體2、抗體的基本結(jié)構(gòu)N端可變區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵輕鏈重鏈C端CDR區(qū)識別抗原構(gòu)架區(qū)第一節(jié)抗原與抗體

第20頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體①免疫抗體3、抗體的種類

（1）根據(jù)抗體獲得方式分類②天然抗體③自身抗體（2）根據(jù)抗體作用對象分類①抗菌性抗體②抗毒性抗體③抗病毒性抗體④過敏性抗體動物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動物先天就有的抗體，可以遺傳給后代

機體對自身組織成分產(chǎn)生的抗體

細菌或內(nèi)毒素刺激機體所產(chǎn)生的抗體

細菌外毒素刺激機體產(chǎn)生的抗體

病毒刺激機體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動物血清進入機體后所產(chǎn)生的使動物發(fā)生過敏反應(yīng)的抗體

第一節(jié)抗原與抗體

第21頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體4、人工制備抗體用抗原免疫動物，或通過細胞融合技術(shù)和基因工程技術(shù)分別制備多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。（1）多克隆抗體(polyclonalantibody，PoAb)定義：將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個B細胞克隆產(chǎn)生的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。特點：來源廣泛、制備容易，但不易大量制備；特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應(yīng)；評價：應(yīng)用受到限制。第一節(jié)抗原與抗體

第22頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)

————雜交瘤細胞和單克隆抗體技術(shù)原理：淋巴細胞增殖分化的漿細胞(來自脾臟，有抗原特異性，能產(chǎn)生抗體，但短壽)與骨髓瘤細胞(無抗原特異性，但長壽，能在體外無限繁殖)利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進行細胞融合，獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細胞。

特點：純度高、特異性強、效價高、無或少血清交叉反應(yīng)，制備成本低等特性。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

第一節(jié)抗原與抗體

第23頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體4、人工制備抗體第一節(jié)抗原與抗體

單克隆抗體制備示意圖第24頁,共70頁，2024年2月25日，星期天單克隆抗體制作過程第25頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)

應(yīng)用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

①對微生物病原體的鑒定。②特異性抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。③疾病的被動免疫治療和生物導向藥物的制備。④檢測血液中的藥物含量。⑤分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。

第一節(jié)抗原與抗體

第26頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、抗體4、人工制備抗體（3）基因工程抗體（重組抗體）定義：在充分認識Ig基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，按人們的意愿在基因水平上對Ig分子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。關(guān)鍵問題之一是鼠源抗體可引起人抗小鼠抗體(HAMA)的產(chǎn)生。特點：保留天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少了無關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。

第一節(jié)抗原與抗體

第27頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用第一節(jié)抗原與抗體第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用一、抗原抗體反應(yīng)的一般特點二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素三、主要抗原抗體反應(yīng)四、現(xiàn)代免疫學技術(shù)第28頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)反應(yīng)：介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作試驗，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學反應(yīng)。第29頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原抗體反應(yīng)的一般特點1.特異性與交叉性

特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2.可逆性

抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。3.定比性

抗原物質(zhì)是多價的；抗體是雙價的。抗原抗體的結(jié)合是抗原—抗體—抗原—抗體這樣順次結(jié)合，只有當兩者比例合適時，聚集成較大的復合物才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第30頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原抗體反應(yīng)的一般特點3.定比性第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用圖7-4沉淀反應(yīng)的曲線第31頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、抗原抗體反應(yīng)的一般特點4.階段性

第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點是反應(yīng)快，不被肉眼所見。第二階段：可見階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解質(zhì)、pH值和溫度的影響。5.敏感性

高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第32頁,共70頁，2024年2月25日，星期天二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素1.電解質(zhì)4.雜質(zhì)異物0.85％的NaCl生理鹽水2.溫度37℃水浴3.pH值多數(shù)血清學反應(yīng)的適宜pH值為6～8第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第33頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、免疫電泳4、補體結(jié)合實驗

第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第34頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)1、凝集反應(yīng)

定義：顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng)并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。（凝集原，凝集素）一般稀釋抗體(抗血清)，使其與抗原有一合適比例。（1）直接凝集反應(yīng)①玻片法

定性試驗。用已知抗體檢測未知抗原。

用途：鑒定菌種，菌種分型，測定ABO血型等。

②試管法

定量試驗。用已知抗原測定血清中抗體有無及相對含量發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價，滴度

)，以表示血清中抗體的相對含量。

用途：測定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第35頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)1、凝集反應(yīng)（2）間接凝集反應(yīng)定義：利用某些與免疫無關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體，將可溶性抗原(或抗體)吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體

(或抗原)結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原(或抗體)的載體微球稱為免疫微球。特點：增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第36頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條件下，形成肉眼可見的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）

凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別：凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需抗體量多，抗原稀釋。

以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價。類型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴散法（單向和雙向）。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第38頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)圖7-5瓊脂雙向擴散的幾種不同方式結(jié)果示意圖第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第39頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)3、免疫電泳將瓊脂擴散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學檢驗方法。

特點：特異性強、很高的靈敏性和分辨力。用途：分析抗原或抗體純度。

類型：對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫電泳。（1）對流免疫電泳這是一種將雙向擴散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。

原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場負、正極附近的小孔中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負極移動，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會形成一條沉淀線。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第40頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)3、免疫電泳（2）火箭免疫電泳定義：抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個方向泳動，兩者比例合適時，在較短時間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀線。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用圖7-6火箭電泳結(jié)果示意圖第41頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)3、免疫電泳（3）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清的凝膠上，進入垂直方向的第二次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。

第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用

圖7-7雙向免疫電泳示意圖

第42頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)3、免疫電泳（4）瓊脂免疫電泳先進行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴散的血清學檢驗技術(shù)。定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴散，在兩者比例適合處形成可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第43頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)4、補體結(jié)合實驗定義：有補體參與，并以綿羊紅血球和溶血素(紅細胞的特異抗體)是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。原理：補體沒有特異性，可與任何抗原抗體復合物發(fā)生結(jié)合(即不能與單獨的抗原或抗體結(jié)合)，一旦結(jié)合后并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。通常應(yīng)用溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補體是否已被抗原抗體復合物結(jié)合。游離補體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應(yīng)。補體結(jié)合試驗有抗原、抗體、補體、紅血球、溶血素5種成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第44頁,共70頁，2024年2月25日，星期天三、主要抗原抗體反應(yīng)4、補體結(jié)合實驗

第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用圖7-9補體結(jié)合實驗示意圖

第45頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用三、主要抗原抗體反應(yīng)4、補體結(jié)合實驗（1）反應(yīng)系統(tǒng)(試驗系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng))

由已知抗原(或抗體)、被檢抗體(或抗原)和補體組成。先加入抗原、抗體，再加入補體，混合后作用一定時間。如果抗原和抗體相對應(yīng)，形成抗原抗體復合物，則補體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2）指示系統(tǒng)(溶血系統(tǒng))由紅血球(抗原)和溶血素(抗體)組成。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。不發(fā)生溶血：補體被抗原抗體復合物結(jié)合，陽性反應(yīng)。發(fā)生溶血：液體中的抗原抗體不相對應(yīng)，沒有發(fā)生結(jié)合，補體依然游離存在，反應(yīng)陰性。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第46頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)現(xiàn)代免疫學技術(shù)包括免疫標記技術(shù)、免疫定位分析、免疫親和層析和免疫生物傳感器技術(shù)等，其中尤以免疫標記技術(shù)發(fā)展最快，應(yīng)用最廣。免疫標記技術(shù)：將某些小分子物質(zhì)作為標記劑（如熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上，不影響抗原抗體反應(yīng)，更容易觀察，提高檢測的靈敏度。標記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察；既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第47頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)免疫標記技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)2、免疫酶技術(shù)3、放射免疫測定法4、免疫電鏡技術(shù)第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第48頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）定義：一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應(yīng)，以提高免疫反應(yīng)靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標記技術(shù)。熒光素濃度在10-8時，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。原理：在一定條件下以化學方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標本中的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見物體，即可達到檢出抗原的目的。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(RB200)，在藍紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光?；痉椒ǎ褐苯臃?，間接法、補體結(jié)合法和標記法。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第49頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）（1）直接法（2）間接法（3）補體結(jié)合法（4）標記法第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用圖7-10免疫熒光抗體法原理示意圖第50頁,共70頁，2024年2月25日，星期天直接免疫熒光法第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第51頁,共70頁，2024年2月25日，星期天間接接免疫熒光法第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第52頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)

免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的血清學檢驗方法。一種酶作標記的抗體或抗抗體的高靈敏度的免疫標記技術(shù)。原理：利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的疫學反應(yīng)特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗原抗體反應(yīng)后，于相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生可見的不溶性有色產(chǎn)物。與免疫熒光技術(shù)區(qū)別：有色的沉淀物可在光學顯微鏡下進行細胞水平的抗原追蹤，也可在電子顯微鏡下進行分子水平的觀察，又能用分光光度計定量測定酶作用底物分解的量。2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）目前常用辣根過氧化物酶(HRP)，也有用堿性磷酸酶標記抗體第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用第53頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA，酶標法)ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的生物學技術(shù)之一。原理：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA試驗中需要有3種試劑：①固相的抗原或抗體。目前多用聚苯乙烯酶標板(微量滴定板)作為固相載體②酶標記的抗原或抗體。③酶作用的底物。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第54頁,共70頁，2024年2月25日，星期天抗原捕獲ELISA第55頁,共70頁，2024年2月25日，星期天1、把抗體固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白；3、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一個供檢測用的酶（辣根過氧化物酶）4、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測定。第56頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共70頁，2024年2月25日，星期天ELISAforHIVantibody

MicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity第58頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強。②酶標抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。③操作簡便④應(yīng)用范圍廣泛。

ELISA技術(shù)用于檢測多種病原菌抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細胞因子等。在食品加工領(lǐng)域，ELISA技術(shù)可用于測定蛋白質(zhì)，也可用于測定各種生物活性成分，如異黃酮半抗原。在食品安全方面，用于檢測食品中農(nóng)藥殘留，以及檢測食品中的病原菌及其毒素，如沙門氏菌及其內(nèi)毒素和腸毒素、大腸桿菌及其腸毒素和腸細胞出血毒素、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、霉菌和真菌毒素。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第59頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法ELISA方法：將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體上，再滴加酶標記的抗原或抗體，然后添加底物，進行免疫酶反應(yīng)，以酶標儀測定。①雙抗體夾心法本法用于檢測抗原。圖7-11雙抗體夾心法測抗原示意圖

標本（含抗體）酶標抗體

底物

固相抗體第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第60頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法②間接法

圖7-11間接法測抗原示意圖

標本（含抗體）酶標抗體

底物

固相抗原第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第61頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法③斑點酶免疫吸附法(dot-ELISA)本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：A用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；B最終顯色反應(yīng)是不溶于水的有色沉淀物，例如，堿性磷酸酶的底物不能用對硝基酚磷酸鹽，而要用氮藍四唑(NBT)等。最終可從薄膜上沉淀物顏色的有無或多少確定結(jié)果。優(yōu)點：靈敏度高(比普通ELISA高10～100倍)，與放射免疫測定相當。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第62頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法④生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用

親和素是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個親和素分子由4個亞基組成，可與4個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；生物素是存在于蛋黃中的維生素H，化學方法制成的生物素衍生物——生物素-羥基琥珀亞胺酯(BNHS)可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、抗體、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子。生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學活性。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第63頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法④生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用

在生物素-親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素-生物素酶復合物，追蹤生物素標記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個生物素，且1個親和素分子可結(jié)合4個生物素分子，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進一步提高ELISA檢測的靈敏度。BAS除用于抗原抗體檢測外，還可用于檢測DNA和RNA。第二節(jié)抗原與抗體反應(yīng)及其應(yīng)用四、現(xiàn)代免疫技術(shù)第64頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第七章免疫學方法及其應(yīng)用2、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（1）酶聯(lián)免疫吸附法④生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用

生物素-親和素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌项A先包被親和素，再用吸附法包被固相的抗體或抗原，進而再與生物素結(jié)合，通