高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離

高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離Nature傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作ColumnChromatographyThinLayerChromatographyTraditionalResearchWorkofNaturalProductsChemistry第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天?傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作，百分之九十左右的時(shí)間在和一根柱子，一塊板子打交道。如何實(shí)現(xiàn)分離手段的多樣化？如何提高研究工作的效率？如何實(shí)現(xiàn)分離工作的儀器化，自動(dòng)化，程序化？如何利用各種儀器的互補(bǔ)功能設(shè)計(jì)新的分離思路，創(chuàng)造新的分離手段？Whereisthewayout?第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天高速逆流色譜儀的出現(xiàn)，使得天然產(chǎn)物工作者看到了一絲曙光……AppearanceofHSCCC……Ourhope……第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天★HSCCC分離天然產(chǎn)物方法學(xué)研究★HSCCC分離香豆素類化學(xué)成分研究★HSCCC分離黃酮類化學(xué)成分研究★

HSCCC分離生物堿類化學(xué)成分研究★HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究★HSCCC聯(lián)用分離技術(shù)研究主要內(nèi)容：Contents:MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproductsResearchofHSCCCinseparationofcoumarinsResearchofHSCCCinseparationofflavonoidsResearchofHSCCCinseparationofalkaloidsResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextractResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天研究思路ResearchpatternHPLC分析方法的建立HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇(分配系數(shù)的測定)HSCCC分離條件優(yōu)化及HSCCC分離純化化合物純度測定化合物結(jié)構(gòu)鑒定樣品制備重要成分活性研究第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC分離天然產(chǎn)物方法學(xué)研究MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproducts第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分離方法建立步驟：1.根據(jù)化合物極性、溶解性特點(diǎn)，結(jié)合同類型化合物研究文獻(xiàn)，確定備選溶劑系統(tǒng)。2.建立目標(biāo)化合物的TLC、HPLC分析條件。3.由所建立的HPLC分析條件準(zhǔn)確測定各目標(biāo)化合物在備選溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。4.由分配系數(shù)估算相應(yīng)保留時(shí)間，分離度及峰寬等色譜參數(shù)。5.選擇性的選取具有適宜色譜參數(shù)的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試。6.優(yōu)化預(yù)試條件，確立最佳條件。Processofmethoddevelopment第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天水溶性和強(qiáng)極性正丁醇-醋酸-水正丁醇-甲醇-水(緩沖液)正丁醇-乙酸乙酯-水(緩沖液)乙酸乙酯-水(緩沖液)中等極性(氯仿溶解)氯仿-甲醇-水乙酸乙酯-甲醇-水正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)弱極性(正己烷溶解)正己烷-乙腈正己烷-甲醇-水正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)天然產(chǎn)物HSCCC溶劑系統(tǒng)選擇（皂苷、強(qiáng)心苷、黃酮苷、多酚類等）（香豆素、醌類、苯丙素、生物堿、黃酮等）（萜類、甾體、脂肪酸等）Selectionofsolventsystems第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

HPLC法測定分配系數(shù)的理論基礎(chǔ)

（上相）TheoreticalbaseofK-valuedeterminationbyHPLC第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分配系數(shù)(KD)與保留因子(κ)

關(guān)系研究Κ＝（VR－VM）/VM

Κ

＝KD（VS/VM）

＝KDφΦ——相比VR

＝VM＋KDVS

RelationshipofKDandK第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分配系數(shù)(K)與分離度(Rs)

關(guān)系研究RelationshipofKandRs第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天0.821.272.023.004.485.13HSCCC峰寬度與分配系數(shù)K的關(guān)系分配系數(shù)保留時(shí)間(min)色譜峰寬(min)0.82118.210.41.27147.715.22.02196.223.23.00260.334.74.48355.952.95.13398.860.9RelationshipofKandpeakwidth第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天峰寬－分配系數(shù)關(guān)系圖保留時(shí)間－峰寬－分配系數(shù)關(guān)系圖第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分離度與分配系數(shù)關(guān)系在螺旋管體積為300ml，相比為1，流速為2ml/min時(shí)，

tM=75min

K2/K1>1.2：Rs>1.0,兩組分峰重疊小于2%K2/K1>1.31：Rs>1.5,兩組分峰重疊小于1%

兩組分分離程度的判斷依據(jù)第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究HSCCC分離香豆素類化學(xué)成分研究ResearchofHSCCCinseparationofcoumarins第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天白花前胡P.praeruptorumDunn.紫花前胡P.decursivum(Miq.)Maxim前胡Qian-hu1化學(xué)成分研究進(jìn)展

以香豆素類化合物為主白花前胡:

以7,8-二氫吡喃駢香豆素類化合物為主紫花前胡:

以6,7-二氫吡喃駢香豆素類化合物為主2藥理研究進(jìn)展

心血管系統(tǒng)保護(hù)作用 抗血小板凝集作用 抗過敏作用 祛痰作用 抗癌作用

第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色譜圖色譜柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mmI.D.,5μm)

流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫模式：0-15min，乙腈比例由50%線性變?yōu)?0%15-30min，由60%線性變?yōu)?0%35min后，70%乙腈

色譜柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mm,5μm)

流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫模式：0-24min，50%乙腈24-40min，乙腈由50%線性變?yōu)?5%第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分離條件的摸索針對香豆素類化合物具有較低極性的特點(diǎn)，采用經(jīng)濟(jì)適用環(huán)保的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4～7:6～3)系統(tǒng)，流速1～2ml/min，分離溫度20～35

C

，根據(jù)等度洗脫各峰保留時(shí)間以及分離度決定是否采用梯度模式以及相應(yīng)梯度條件。分離條件溶劑系統(tǒng)螺旋管的轉(zhuǎn)速流動(dòng)相的流速分離溫度梯度模式SolventsystemFlowrateRevolutionspeedColumntemperatureGradientmodeSeparationcondition第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天溶劑系統(tǒng)（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:5:5)1.101.744.4810.32石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5.5:4.5)0.831.272.817.65石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:6:4)0.430.642.184.99石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:6.5:3.5)0.240.311.282.33白花前胡各溶劑系統(tǒng)的K值測定第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天溶劑系統(tǒng)（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)K(V)K(VI)乙酸乙酯-水(5:5)11.6----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)5.72----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:2:5)3.03----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:3:5)2.72----------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4:5)0.42----------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5:5)0.257.5212.5------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:6:5)0.174.686.1211.3----石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:4)0.071.011.412.183.194.24石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:3)0.020.830.931.341.872.15紫花前胡各溶劑系統(tǒng)的K值測定第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天PW=11.726K推算由及白花前胡HSCCC溶劑體系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）以及（5:5:6.5:3.5）較為合適，采用梯度洗脫可使各目標(biāo)化合物均具有較好分離度，適宜的峰寬和保留時(shí)間。而紫花前胡HSCCC溶劑體系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4）效果較為理想。第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色譜圖螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min流動(dòng)相流速：2.0mL/min分離溫度：35

C流動(dòng)相梯度模式：

0-150min:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）的下相

150-300min:由5:5:5:5的下相線性變?yōu)?:5:6.5:3.5的下相

300min后:流動(dòng)相為5:5:6.5:3.5的下相

螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min流動(dòng)相流速：2.0mL/min分離溫度：20

C溶劑系統(tǒng)：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v），上相為固定相，下相為流動(dòng)相第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天JournalofChromatographyA.2004,1057(1-2):89-94.2005,1076(1-2):127-32

第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天★Pd-D-V是首次以純化合物形式分離得到，說明了HSCCC方法的分辨能力很高?！颫struthin(歐芹素)首次從紫花前胡中分離得到。Ostruthin的含量并不低，但在以前的研究中未從紫花前胡中分離得到，這可能是由于該化合物在常規(guī)分離過程中易發(fā)生變化或易形成死吸附，這也說明了HSCCC方法的優(yōu)越性。小結(jié)：conclusion第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究HSCCC分離黃酮類化學(xué)成分研究ResearchofHSCCCinseparationofflavonoids第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天淫羊藿Y(jié)ingYangHuo

朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai.

系小檗科淫羊藿屬植物(EpimediumkoreanumNakai.)的地上全草,主產(chǎn)于我國的遼寧、吉林等地1化學(xué)成分研究進(jìn)展

8-異戊烯基取代的黃酮類化合物2藥理研究進(jìn)展心腦血管、免疫系統(tǒng)、骨代謝、生殖系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用,還有抗腫瘤作用第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天樣品的制備60

C干燥粉碎至約30目1000g藥材10L70%乙醇回流提取2次浸膏上D101大孔吸附樹脂柱水洗至無色，5L70%乙醇洗脫減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干11.5g干粉回收溶劑Preparationofsample第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天色譜柱：YWGC18

柱(200mm×4.6mmI.D.,10μm)；流動(dòng)相：乙腈-水0-12min:28%乙腈12-20min:乙腈由28%線性變?yōu)?5%30min:35%乙腈流動(dòng)相流速：1.0mL/minHPLC分析方法建立HPLCanalysis第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯-水：IcarisideII的純度僅有68.2%乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)：只有icariin的純度較高，IcarisideII和epimedokoreanosideI的純度較低，均不足80%當(dāng)用乙酸乙酯-甲醇-水(5:2:5)

：所有的化合物的純度均較差。氯仿-甲醇-水系統(tǒng)：分離條件的摸索根據(jù)黃酮極性特點(diǎn)，嘗試采用乙酸乙酯-甲醇-水(5:0~3:5)，氯仿-甲醇-水(4:2.5~4:2)等體系：PW=11.726K推算由及適宜比例為4:3.5:2，此時(shí)各目標(biāo)化合物均具有較好分離度，合適的峰寬和保留時(shí)間。Separationcondition第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min

流動(dòng)相流速：2.0mL/min

分離溫度：25

C

溶劑系統(tǒng)：

氯仿-甲醇-水4:3.5:2上相為固定相，下相為流動(dòng)相98.7%99.1%98.2%HSCCC色譜圖JournalofChromatographyA.2005,1064(1):53-7

第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究HSCCC分離生物堿類化學(xué)成分研究ResearchofHSCCCinseparationofalkaloids第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天吳茱萸WuZhuYu

吳茱萸

Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth(E.rutaecarpa),為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的近成熟果實(shí)，分布陜西、甘肅、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、貴州、云南、廣東和廣西等省區(qū)。秋季果實(shí)將近成熟尚未開裂時(shí)采收，除去果柄，曬干或烘干。1化學(xué)成分研究進(jìn)展主含生物堿：吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸因堿、羥基吳茱萸堿、吳茱萸卡品堿。2藥理研究進(jìn)展胃腸道作用，鎮(zhèn)痛，中樞刺激，止血止瀉等第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天色譜柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mmI.D.,5um)流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水0-22min:15:38:4722-65min:45:38:17流動(dòng)相流速：1.0mL/min檢測波長：254nmHPLC分析方法建立吳茱萸乙酸乙酯超聲提取物（生物堿部位）HPLCanalysis第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯-水：生物堿基本分布于固定相中；乙酸乙酯-甲醇-水：當(dāng)甲醇含量稍高時(shí)系統(tǒng)不易分層；環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲醇－水：在引入環(huán)己烷后改善了系統(tǒng)分層狀況。其中甲醇比例較小時(shí)，出峰延遲，峰型過寬；甲醇比例較大時(shí)固定相保留不理想。分離條件的摸索根據(jù)此類生物堿極性特點(diǎn)，嘗試采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯-甲醇-水，環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:5~7:5)等體系：PW=11.726K推算由及確定適宜比例為5:5:7:5。Separationcondition第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC色譜圖螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min

流動(dòng)相流速：2.0mL/min

分離溫度：25

C

溶劑系統(tǒng)：

環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水5:5:7:5上相為固定相，下相為流動(dòng)相JournalofChromatographyA,1074(2005)139–144第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究ResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextract第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

天然藥物的總提取物往往含有從脂溶性到水溶性的具有廣泛極性的一系列化學(xué)成分，若僅僅對其中主要成分進(jìn)行HSCCC分離，不僅無法全面反映與活性相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且以一種溶劑系統(tǒng)也難以一次性實(shí)現(xiàn)徹底的分離。若采用傳統(tǒng)的系統(tǒng)溶劑分離法，將總提取物用不同的溶劑逐步劃分為極性從小到大的不同部位，再針對不同部位，使用不同HSCCC溶劑系統(tǒng)進(jìn)一步分離，不僅可以加快整體分離速度，而且有利于追蹤主要活性部位，加大有效先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)幾率，從而使得整個(gè)分離工作的系統(tǒng)性、針對性和完整性得到了大大增強(qiáng)，最終將促進(jìn)HSCCC技術(shù)成為天然產(chǎn)物化學(xué)研究中的常規(guī)分離手段，加快天然藥物化學(xué)研究現(xiàn)代化步伐。第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天蓼科蓼屬植物何首烏的塊根，原植物廣泛分布于四川、云南、河北、河南、山東、廣東、廣西、福建等省

1化學(xué)成分醌類化合物二苯乙烯苷類化合物2藥理作用心血管系統(tǒng)、抗衰老、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)抗腫瘤作用抗病原微生物作用

何首烏HeShouWu第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天500g何首烏藥材5L95%乙醇冷浸,回收乙醇浸膏(28g)300mL水分散,乙醚萃取乙醚部位(8.0g)水溶液正丁醇萃取正丁醇部位(7.5g)水部位(10g)D101大孔吸附樹脂,30%乙醇洗脫精制正丁醇部位(3.5g)Separatedfractions：第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天ShimadzuVP-ODS柱(150×4.6mmI.D.,5

m)。甲醇-水梯度洗脫，0-60min內(nèi)甲醇由5%線性變?yōu)?00%；1.2mL/min；254nm。ShimadzuVP-ODS柱(150×4.6mmI.D.,5

m)。乙腈-水梯度洗脫，0-45min內(nèi)乙腈由1%線性變?yōu)?00%；0.8mL/min；254nm。

乙醚部位精制正丁醇部位HPLC成分分析HPLCanalysis第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天乙醚部位:主要為化合物I-IV采用分步洗脫的方法進(jìn)行分離先用正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）體系使I和II分離開再用9:1:5:5體系的下相作流動(dòng)相，將III洗脫出

IV則留在固定相中，回收固定相得到IV精制正丁醇部位:主要為化合物V-IX用乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50)體系進(jìn)行分離先洗脫出V、VI、VII

改變HSCCC儀器螺旋管的旋轉(zhuǎn)方向，同時(shí)將流動(dòng)相變?yōu)橐宜嵋阴エC甲醇–水(50:1:50)上相，將VIII和IX洗脫出。

分離策略separationtactic第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50):固定相：上相流動(dòng)相：下相300min前正轉(zhuǎn)乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50):固定相：下相流動(dòng)相：上相300min后正轉(zhuǎn)HSCCC分離：獲得不同極性的一系列化合物200min前流動(dòng)相為正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）下相，200min后為9:1:5:5下相，600min后停機(jī)吹出固定相

乙醚部位精制正丁醇部位(先)精制正丁醇部位(后)JournalofChromatographyA.2006,1115:64-71.第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

HSCCC聯(lián)用分離技術(shù)研究ResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天分析儀器IR、MS、TLC、HPLC-DAD分離儀器HSCCCn

、PHPLC、SFE檢測儀器UV-VIS、RID、ELSD第45頁,共51頁，2024年2月25日，星期天目前進(jìn)行HSCCC聯(lián)用研究時(shí)需要考慮以下問題：1．連接問題：目前僅借助通用分流閥來實(shí)現(xiàn)。沒有專門的接口技術(shù)，也沒有實(shí)現(xiàn)接口的模塊化和自動(dòng)化。2．流動(dòng)相問題：

HSCCC適用的溶劑范圍十分寬泛,但與之相連的儀器溶劑范圍并不寬泛。3．分流問題：對于不同檢測限的設(shè)備，為了達(dá)到不同的目的（分析或者制備），需采用不同