色譜分析方法

色譜分析方法一、色譜分析法概述

色譜分析法已成為當(dāng)代科技迅速發(fā)展時(shí)期的最適宜的最重要的分離分析方法，形成了一門新興學(xué)科――色譜法。氣相色譜、液相色譜、凝膠滲透色譜、離子色譜等都得到了廣泛深入的應(yīng)用。第2頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

色譜法的獨(dú)到之處在于它的高分離效能，實(shí)質(zhì)是討論譜峰間的距離和譜峰的寬窄，即所謂色譜柱的高效性和高選擇性。這兩個(gè)性能指標(biāo)的理論本質(zhì)，是由組分在兩相中分配系數(shù)不同的熱力學(xué)過(guò)程和組分在兩相中擴(kuò)散速度不同的動(dòng)力學(xué)過(guò)程所決定的。第3頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天因此，要達(dá)到多組分復(fù)雜混合物通過(guò)色譜柱理想地分離，就必須從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行綜合性地研究；同時(shí)對(duì)難分離物質(zhì)要選擇最佳色譜分離條件，以達(dá)到快速分離的目的。第4頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、色譜方法的分類隨著色譜理論的不斷完善和色譜技術(shù)的進(jìn)步，其分類方法眾多，常見(jiàn)的如下：用氣體作為流動(dòng)相氣相色譜法Gaschromatography(GC)液相色譜法Liquidchromatography(LC)用液體作為流動(dòng)相A、按兩相狀態(tài)分類：以流動(dòng)相狀態(tài)為準(zhǔn)劃分方法類型第5頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天等十余種方法。

B、按樣品組分在兩相間分離機(jī)理分類:

利用組分在流動(dòng)相和固定相之間的分離原理不同而命名的分類方法。吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠滲透色譜法離子色譜法超臨界流體色譜法???第6頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、色譜技術(shù)問(wèn)題色譜技術(shù)有如下幾方面：進(jìn)樣技術(shù)，特別是關(guān)于毛細(xì)管色譜的進(jìn)樣技術(shù)；色譜柱制備技術(shù)；固定相和流動(dòng)相的選擇技術(shù)；多維色譜系統(tǒng)組合切換技術(shù)；流出組分檢測(cè)技術(shù)；程序升溫技術(shù)和剃度洗脫技術(shù)等。這些技術(shù)都在實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用和繼續(xù)提高，是色譜工作的一個(gè)重要方面。第7頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、色譜儀器色譜儀器是驗(yàn)證色譜理論和色譜技術(shù)應(yīng)用的重要手段，也是建立各種分析方法的必須條件。上世紀(jì)90年代以來(lái)，色譜儀器的多樣化、高精化、智能化等程度日新月異。著名的色譜儀器廠家有：美國(guó)的安捷倫公司、waters公司、日本的島津公司等，國(guó)內(nèi)的上海、大連等公司也生產(chǎn)了質(zhì)量較高的色譜儀。第8頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、色譜法的應(yīng)用由于色譜法獨(dú)具特點(diǎn)，使它在各領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。石油化學(xué)環(huán)境科學(xué)和環(huán)境保護(hù)生物學(xué)、微生物化學(xué)、生命科學(xué)食品工業(yè)、農(nóng)林牧漁業(yè)醫(yī)學(xué)及醫(yī)藥學(xué)商品檢驗(yàn)???應(yīng)用領(lǐng)域第9頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、色譜法的本質(zhì)及流程

1、

色譜法的本質(zhì)色譜法的本質(zhì)在于色譜柱高選擇性和高效能的分離作用與高檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合。

第10頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天混合組分的樣品在色譜柱中分離的依據(jù)是：同一時(shí)刻進(jìn)入色譜柱中的各組分，由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用的不同，隨流動(dòng)相在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103～106）地分配過(guò)程，使得原來(lái)分配系數(shù)具有微小差別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組分在色譜柱中的移動(dòng)速度就不同，經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的色譜柱后，彼此分離開(kāi)來(lái)，最后按順序流出色譜柱而進(jìn)入信號(hào)檢測(cè)器，在色譜數(shù)據(jù)機(jī)上顯示出各組分的色譜行為和譜峰數(shù)值。第11頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、

色譜方法的裝置系統(tǒng)流程色譜方法裝置流程圖見(jiàn)下圖5-記錄儀二、色譜法的本質(zhì)及流程

1-流動(dòng)相及控制裝置；2-流動(dòng)相凈化器3-色譜柱4-檢測(cè)器第12頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、色譜分析法的一般特點(diǎn)1、

高選擇性色譜分析方法對(duì)那些性質(zhì)極為相似的物質(zhì)，如同位素、同系物和烴類異構(gòu)體等有良好的分離效果。這種選擇分離，主要采用高選擇性固定液，使各組分間的分配系數(shù)能產(chǎn)生較大的差別而實(shí)現(xiàn)保留值不同。

第13頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、高效能色譜分析法對(duì)那些沸點(diǎn)極為相近的多組分混合物和極其復(fù)雜的多組分混合物，有能力改善它們的峰形，使各組分彼此間有良好的分離效能。這種高效能作用,主要是通過(guò)色譜柱具有足夠的理論塔板數(shù)（填充柱為幾千塊/m，毛細(xì)管柱可達(dá)105～106塊/m）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第14頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、高靈敏性色譜分析法的高靈敏度檢測(cè)信號(hào)，表現(xiàn)在檢測(cè)器方面。目前在色譜界已出現(xiàn)幾十種檢測(cè)器，可檢測(cè)出10－11～10－13g的物質(zhì)量。因此在痕量分析中可大顯功效。如超純氣體、高純?cè)噭┲械膒pm→ppb級(jí)的痕量雜質(zhì)測(cè)定，測(cè)定大氣污染物中的ppb→ppt級(jí)的痕量毒物；測(cè)定農(nóng)、副產(chǎn)品、水果、食品中的ppm→ppb級(jí)的農(nóng)藥殘留物。第15頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、

分析速度快

色譜分析法，特別是氣相色譜法，分析速度較快。一般較為復(fù)雜的樣品可在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成。而且現(xiàn)在的色譜儀器多數(shù)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)化，配以高速分離的色譜系統(tǒng)，分析速度會(huì)更快。第16頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、

GC與LC特點(diǎn)之比較兩種色譜法的根本區(qū)別在于流動(dòng)相狀態(tài)。氣相色譜法多由永久性氣體作流動(dòng)相，由于載氣相對(duì)分子質(zhì)量低，分子間空隙大，故粘度低，流動(dòng)性好，組分在氣相中運(yùn)輸速度快，流動(dòng)相滲透性強(qiáng)，因此可以增加柱長(zhǎng)，提高色譜柱理論塔板數(shù)，從而增加柱效；第17頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天氣體作流動(dòng)相價(jià)格較液體的有機(jī)溶劑低廉；氣相色譜法可以選擇愈來(lái)愈多的合成新固定液；氣相色譜法分析的對(duì)象多為相對(duì)分子質(zhì)量M<1000、低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較好的化合物，而且，樣品必須在柱前變成氣態(tài)分子，否則不能隨載氣運(yùn)輸分離。對(duì)于大分子、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的化合物較為困難。裂解氣相色譜法可以對(duì)高分子化合物進(jìn)行裂解后分離分析。第18頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天液相色譜法采用液體作流動(dòng)相。適于作液相色譜的流動(dòng)相較僅有幾種惰性氣體的GC流動(dòng)相多；流動(dòng)相對(duì)樣品組分有較好的溶解作用，且參與溶質(zhì)的分配，可增大分離的選擇性。液相色譜適于分析高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的、分子量（M＝1000～2000）較大的液體化合物，樣品可直接進(jìn)樣，一般不需作樣品衍生化處理。

第19頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天選擇好流動(dòng)相是改善液相色譜分離的關(guān)鍵之一（液體種類繁多，選用二元或三元流動(dòng)相時(shí)同時(shí)洗脫，改變載液的種類濃度、比例、極性、PH穩(wěn)定等，則可以提高LC的分離度）；流動(dòng)相因?yàn)槭且后w，所以密度較高，組分?jǐn)U散系數(shù)（DL）低（大約占?xì)怏w的10－5），故LC分析速度慢；液體粘度大于氣體100多倍，傳質(zhì)也較慢，故采用小顆粒，窄分布固定相和高壓泵強(qiáng)制流動(dòng)相通過(guò)色譜柱以獲得高效率分離；高效液相色譜有其獨(dú)特的檢測(cè)器，如紫外檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、熒關(guān)檢測(cè)器等，它們都有高的靈敏度；高效液相色譜可進(jìn)行大組分量制備，收集柱流出組分十分方便。第20頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、色譜基本理論1、

色譜圖色譜圖是色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或載氣流出體積的曲線圖。色譜圖是色譜基本參數(shù)的源流，可根據(jù)色譜圖中峰位置點(diǎn)進(jìn)行定性，根據(jù)峰高或峰面積進(jìn)行定量；根據(jù)各峰不同的位置及其峰寬變化狀態(tài)，可對(duì)色譜柱的分離性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，表征色譜操作條件的優(yōu)劣。第21頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、色譜圖相關(guān)名詞（色譜）峰（Chromatographic）Peak

色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。

峰底Peakbase

峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線（見(jiàn)圖3中的CD）。

峰高（h）PeakHeight

從峰最大值到峰底的距離（見(jiàn)圖3中的BE）。

峰寬（W）PeakWidth 在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離（見(jiàn)圖3中的KL）。

第22頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜流出曲線圖第23頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

半高峰寬（Wh/2）PeakWidthathalfheight通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（見(jiàn)圖3中的HJ）。

峰面積（A）Peakarea峰與峰底之間的面積（見(jiàn)圖3中的CHEJDC）。

標(biāo)準(zhǔn)偏差（ɑ）Standarderror0.607倍峰高處所對(duì)應(yīng)峰寬之一半。

第24頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天

拖尾峰TailingPeak后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。

前伸峰leadingPeak前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。假峰GhostPaek并非由試樣所產(chǎn)生的峰?；畏錎istortedPeak形狀不對(duì)稱的峰，如脫尾峰、前伸峰。第25頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天基線Baseline在正常操作條件下，僅有載氣通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線?；€漂移Baselinedrift基線隨時(shí)間定向的緩慢變化?；€噪聲（N）Baselinenoise由各種因素所引起的基線波動(dòng)。第26頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、色譜基本參數(shù)

1、

死時(shí)間（tM）Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大值所需的時(shí)間（見(jiàn)圖3中的tM）。2、

保留時(shí)間（tR）Retentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間（見(jiàn)圖3中的tR）調(diào)整保留時(shí)間（t’R）Adjustedretentiontime減去死時(shí)間的保留時(shí)間（見(jiàn)圖3中的t‘R）t’R＝tR—.tM3、

死體積（VM）DeadVolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣體積。第27頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、

保留體積（VR）RetentionVolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的載氣體積。VR=tR.FCFC－載氣流速（ml/min）。5、

柱效能Columeefficiency色譜柱在色譜分離過(guò)程中主要由動(dòng)力學(xué)因素（操作參數(shù)）所決定的分離效能。通常用理論板高或有效板數(shù)表示。 ①、理論板數(shù)（n）Numberoftheoreticalplate表示柱效能的物理量，可由下式計(jì)算n=5.54(tR/W)2=16()2②、理論板高（H）Heightequivalenttoatheoreticalplate單位理論板的長(zhǎng)度。H=L/n ③

有效板數(shù)（neff）Numberofeffectiveplate減去死時(shí)間后表示柱效能的物理量，可由下式計(jì)算：neff＝5.54()2=16()2第28頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜的定性分析

一般定性

1、用已知物直接對(duì)照法定性利用已知物直接對(duì)照法定性，是一種簡(jiǎn)單可靠的定性方法，在具有已知標(biāo)準(zhǔn)物情況下常使用這種定性方法。該方法定性的依據(jù)是：在一定的柱條件（柱長(zhǎng)、固定相），操作條件下，組分有固定的保留值。因此，控制條件一定，比較已知物和未知物的保留值，就可方便地確定某一色譜峰是什么物質(zhì)。 A、利用保留時(shí)間和保留體積定性利用保留時(shí)間tR定性是最簡(jiǎn)單地一種定性方法。只要準(zhǔn)確測(cè)量未知物和標(biāo)準(zhǔn)物地保留時(shí)間進(jìn)行比較，相同者為同一物質(zhì)。利用保留時(shí)間定性，缺點(diǎn)是tR受操作條件影響大，載氣流速微小的波動(dòng)、穩(wěn)定微小的變化都會(huì)使tR改變，從而給定性帶來(lái)困難。用保留體積VR定性，不受載氣流速的影響，操作也很方便。第29頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天 B、用相對(duì)保留值定性利用保留時(shí)間或保留體積定性受條件影響大。保留體積雖不受流速影響，仍受其它操作條件影響。而相對(duì)保留值僅受柱溫、固定相性質(zhì)影響，柱長(zhǎng)、填充情況、流速等均不影響ris值。因此在柱溫、固定相一定時(shí)，ris為定值，可作為定性的較為可靠的參數(shù)。 C、用已知物增加峰高法定性如果樣品組成復(fù)雜，峰間距小，這時(shí)要準(zhǔn)確定出保留值有一定困難，峰高增加法是在此條件下最可靠的定性方法。具體方法是：先進(jìn)一樣品，得一譜圖，然后在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同樣條件下進(jìn)一針標(biāo)樣品，從新得到的譜圖上看，哪個(gè)峰高了，那么，該峰就是加入的標(biāo)準(zhǔn)物組分。第30頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、色譜定量分析色譜分析的重要作用之一是對(duì)樣品定量。色譜法定量的依據(jù)是：組分的重量或在載氣中的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比。在此，響應(yīng)信號(hào)指峰面積或峰高，表示為：wi=fiAi，其中wi為欲測(cè)組分I的量，Ai為組分I的峰面積，fi為比例系數(shù)，在此稱為校正因子。因此，要準(zhǔn)確定量，首先要準(zhǔn)確測(cè)出峰面積與定量校正因子。定量校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位峰面積所代表的被測(cè)組分的量。定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與響應(yīng)信號(hào)成正比，但是，同一含量的不同物質(zhì)，由于其物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)大小也不同，直接用響應(yīng)信號(hào)定量，必然產(chǎn)生較大誤差。因此提出了定量校正因子。定量校正因子對(duì)信號(hào)加以校正，校正后的峰面積可定量地代表物質(zhì)的含量。第31頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天A、

面積的測(cè)量①

對(duì)稱峰面積的測(cè)量對(duì)稱色譜峰近似地看作一個(gè)等腰三角形，按照三角形求面積的方法，峰面積為Ai＝hiW，經(jīng)驗(yàn)證明該方法計(jì)算的面積只有實(shí)際面積的0.94倍，故再乘一系數(shù)1.065，Ai＝1.065hiW，這是目前應(yīng)用較廣的計(jì)算法。1、

不對(duì)稱峰面積的測(cè)量在色譜分析中，經(jīng)常會(huì)遇到不對(duì)稱峰，多數(shù)不對(duì)稱峰為拖尾峰，峰面積的計(jì)算方法為：取峰高0.15倍處和0.85倍處峰寬平均值，乘峰高：A=(W0.15h+W0.85h)×h峰高在定量分析中的作用峰高也可作為定量指標(biāo)，對(duì)于一定的樣品，如果操作條件保持不變，在一定的進(jìn)樣量范圍內(nèi)，半高峰寬是不變的，峰高可直接代表組分的濃度，由峰高代替面積計(jì)算。方法快速、簡(jiǎn)便，適用于固定不變的常規(guī)分析。與使用面積定量法比較，對(duì)于出峰早的組分，由于半高峰寬很小，相對(duì)誤差大，這時(shí)用峰高定量更準(zhǔn)確。對(duì)于出峰晚、峰較寬的組分，用峰面積定量更準(zhǔn)確。第32頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天百分含量的計(jì)算

1、

歸一化法歸一化法是常用的一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量方法。使用這種方法的條件是樣品中所有組分都出峰，將所有出峰組分的含量之和按100％計(jì)，當(dāng)測(cè)量參數(shù)為面積時(shí)，計(jì)算如下：xi%=×100

式中xi---試樣中組分i的百分含量；fi---組分i的校正因子；Ai---組分 i的峰面積。如果樣品中組分是同分異構(gòu)體或同系物，已知校正因子近似相等，就可以不用校正因子，將面積直接歸一化，即可按下式計(jì)算：xi(%)=×100

xi(%)=×100

歸一化定量的優(yōu)點(diǎn)是方法準(zhǔn)確，進(jìn)樣量的多少與結(jié)果無(wú)關(guān)，儀器與操作條件對(duì)結(jié)果影響小。缺點(diǎn)是某些組分在所用檢測(cè)器上可能不出峰，樣品中含有沸點(diǎn)高，出峰很慢的組分，不需定量的個(gè)別組分可能分離不好，重疊在一起，影響面積的測(cè)量，使其應(yīng)用受到一定程度的限制。第33頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、

外標(biāo)法外標(biāo)法又稱校正曲線法。用已知純樣品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量各種濃度下對(duì)應(yīng)的峰高或峰面積，繪制響應(yīng)信號(hào)――百分含量標(biāo)準(zhǔn)曲