【生物】基因工程的基本操作程序第一課時 2023-2024學年高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

情境導入轉基因抗蟲棉你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。非轉基因抗蟲棉轉基因抗蟲棉第三章基因工程3.2

基因工程的基本操作程序基因表達載體培育轉基因抗蟲棉的四個步驟與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞抗蟲棉

（有抗蟲特性）導入抗蟲基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的篩選與獲取在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。1.概念：主要是編碼特定蛋白質的基因，也可以是具有調控作用的因子2.實例：轉基因抗蟲棉用到的Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）表達破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲導入抗蟲棉培育棉花細胞3.目的基因的篩選：方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對4.目的基因的獲?。?獲取目的基因的方法：①從基因文庫中獲取②人工合成③利用PCR獲取和擴增目的基因PCR——

.

PCR是一項根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。DNA半保留復制體外PCR擴增儀控制溫度*利用PCR獲取和擴增目的基因聚合酶鏈式反應要點回顧:體內DNA復制要點回顧:體內DNA復制解旋酶DNA聚合酶模板：原料：能量：酶：DNA的兩條母鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶復制特點:①邊解旋邊復制②半保留復制堿基互補配對原則條件復制原則:ATPDNA體內復制所需的基本條件:參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物是一小段能與

的一段堿基序列_________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母鏈（通常20-30個核苷酸）在PCR技術中，解旋沒有用解旋酶，而是利用DNA的熱變性和復性原理當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。變性延伸復性變性90-95?C延伸72?C復性50?C整個過程可以在PCR儀中自動完成循環(huán)30輪左右PCR管

每循環(huán)一次，目的基因增加1倍925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因PCR技術原理圖解：925575℃變性3`5`5`3`925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火視頻：PCR反應過程由于一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴增（約為

，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。變性90℃以上延伸72℃左右復性50℃左右基本過程PCR的結果：PCR產(chǎn)物的鑒定：①n代后，DNA分子有_____個②n代后，DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_____個⑤n代后，含其中一種引物的DNA分子有_____個⑥n代后，共消耗_____個引物⑦第n代復制，消耗了______個引物⑧n代后，完整的(等長）目的基因有_____個2n2n+132n2n+1-22n2n-2n2n-1根據(jù)PCR技術找出以下規(guī)律：圖1、圖2分別是PCR擴增技術相關過程，請思考回答下列問題：1．PCR擴增的是完整的模板DNA分子嗎？并說明理由。不是完整的模板DNA分子；PCR擴增的僅僅是兩種引物之間所對應的特定DNA片段2.圖1所示利用PCR技術擴增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’3’5’第三次循環(huán)3’3’第3輪；1/44．圖2是某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列），都不合理，請分別說明理由。第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發(fā)生堿基互補配對而失效引物Ⅰ′自身折疊后會因出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效3．如果已知某目的基因的序列和結構，利用PCR篩選和擴增出該目的基因的關鍵是什么？根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設計引物。5．要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列6．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對引物？共需消耗2n－1對引物思考:獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因導入受體細胞嗎？就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？二、基因表達載體的構建——基因工程的核心

位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段，RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動轉錄。位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段，終止轉錄。1.目的：2.組成鑒別和篩選出含有目的基因的受體細胞注意：目的基因必須插入到

與

之間DNA復制的起始位點，DNA聚合酶識別和結合位點使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。啟動子終止子辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉錄過程。啟動密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過程。獲取目的基因3.過程重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點DNA連接酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質粒①用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶限制酶基因表達載體構建模式圖載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’12.使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況?補充知識點：1.原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質。(以模板轉錄然后脫落)33①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區(qū)：非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，包括啟動子和終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內含子：外顯子：補充知識點：2.真核細胞的基因結構35非編碼區(qū)非編碼區(qū)內含子

外顯子

轉錄mRNA前體加工翻譯肽鏈