藥物色譜分離技術(shù)-色譜分離操作過程（制藥技術(shù)課件）

色譜分離技術(shù)--薄層色譜分離操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)大綱1.薄層色譜法概念2.薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)薄層色譜法（TLC）：將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定的方法。

薄層色譜操作包括：制板、點(diǎn)樣、展開、顯色、Rf計(jì)算等。（一）薄層色譜法概念薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)1.薄層板的制備

薄層板的薄層應(yīng)盡可能的均勻而且厚度要固定。制備薄層板，首先將吸附劑調(diào)成糊狀：如稱取約3g硅膠G，加入到6-7mL0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液中，調(diào)成均勻的糊狀物。這一步一定要將吸附劑逐漸加入到溶劑中，邊加邊攪拌；如果把溶劑加到吸附劑中，容易產(chǎn)生結(jié)塊。然后采用簡(jiǎn)單的平鋪法和傾斜法將糊狀物涂布在干凈的載玻片上，制成薄層板。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)一般情況薄層越薄分離效果越好。鋪板的方法有兩種：(1)平鋪法：如圖所示，將自制涂布器洗凈，把干凈的載玻片在涂布器中擺好，上下兩邊各夾一塊比載玻片厚0.25mm的玻璃板，在涂布器槽中倒入糊狀物，將徐布器自左向右推，即可將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)(2)傾斜法

如沒有涂布器，則可將調(diào)好的糊狀物倒在載玻片上，用藥匙攤開后，用手搖晃并輕輕敲擊玻板背面，使其糊狀物均勻鋪開且表面均勻光滑。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)涂好的薄層板室溫水平放置晾干后，放入烘箱內(nèi)加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105-110℃活化30min。氧化鋁板在200-220℃烘4h可得活性Ⅱ級(jí)的薄板。150-160℃烘4h可得活性Ⅲ-Ⅳ級(jí)的薄板。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)

薄層板的活性與含水量有關(guān)，其活性隨含水量的增加而下降。注意硅膠板活化時(shí)溫度不能過高，否則硅醇基會(huì)相互脫水而失活?；罨蟮谋討?yīng)放在干燥器內(nèi)保存。（二）薄層色譜分離操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣所用工具如圖所示。先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為基線，然后將樣品溶于低沸點(diǎn)溶劑配成的溶液，用毛細(xì)管點(diǎn)樣。在薄層色譜中，樣品的用量對(duì)物質(zhì)的分離效果有很大影響，所需樣品的量與顯色劑的靈敏度、吸附劑的種類、薄層的厚度均有關(guān)系。（二）薄層色譜操作操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)2.點(diǎn)樣

樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察；樣品量太多，往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，樣點(diǎn)直徑一般以2-4mm為宜。同一薄層上的樣點(diǎn)直徑應(yīng)一致。另外點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。（二）薄層色譜操作操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)3.展開

將薄層板放入適宜的展開缸內(nèi)展開。展開劑液面不要超過薄層板的基線。薄層板的展開需要在密閉的色譜缸(也可用標(biāo)本缸或廣口瓶等)中進(jìn)行，如圖所示。用來展開樣品中各組分的溶劑(流動(dòng)相)稱為展開劑。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)3.展開

先將一定量展開劑放在色譜缸中，蓋上缸蓋，讓缸內(nèi)溶劑蒸氣飽和5-10min。再將點(diǎn)好試樣的薄層板樣點(diǎn)一端朝下放入缸內(nèi)(注意控制器皿中展開劑的量，切勿使樣點(diǎn)浸入展開劑中），蓋好缸蓋，展開劑因毛細(xì)管效應(yīng)而沿薄層上升，樣品中組分隨展開劑在薄層中以不同的速度自下而上移動(dòng)而導(dǎo)致分離。當(dāng)展開劑前沿上升到樣點(diǎn)上方8-10cm時(shí)取出薄層板，放平，鉛筆標(biāo)明溶劑前沿位置，冷風(fēng)吹干溶劑。計(jì)算比移值。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)化合物在薄板上移動(dòng)距離的多少取決于所選取的溶劑不同。但凡溶劑的極性越大，對(duì)化合物的洗脫能力也越大，即Rf值也越大。一個(gè)好的溶劑體系應(yīng)該使混合物中所有的化合物都離開基線，但并不使所有化合物都到達(dá)溶劑前端，Rf值最好在0.15～0.85之間。最理想的Rf值為0.4-0.5。（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)當(dāng)一種溶劑不能很好地展開各組分時(shí)，常選擇用混合溶劑作為展開劑。合適的混合展開劑常需多次仔細(xì)選擇才能確定。

一些常用溶劑和它們的相對(duì)極性：（二）薄層色譜操作薄層色譜分離操作—色譜分離技術(shù)4.顯色展開的薄層板上化合物斑點(diǎn)本身有顏色時(shí)，可直接觀察。若化合物本身無色，可在紫外燈下觀察熒光斑點(diǎn)，也可用顯色劑顯色。簡(jiǎn)單常用的顯色劑是碘蒸氣，廣口瓶中放置少量碘晶體，使用時(shí)將薄層板放入，蓋上瓶蓋，密封瓶?jī)?nèi)的碘蒸氣即可使大部分有機(jī)化合物顯色(飽和烴與鹵代烴除外)。（二）薄層色譜操作色譜分離技術(shù)--薄層色譜原理及特點(diǎn)薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)大綱1.薄層色譜原理2.薄層色譜特點(diǎn)薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)薄層色譜(簡(jiǎn)稱TLC)，屬于固-液吸附色譜，是一種微量的分離分析方法，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、速度快、分離效果好、靈敏度高以及能使用腐蝕性顯色劑等優(yōu)點(diǎn)。適用于小量樣品的分離。薄層色譜是一種非常有用的跟蹤反應(yīng)的手段，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。

常用作柱色譜的先導(dǎo)，可用于柱色譜分離中展開劑的選擇，可監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)最常用的薄層色譜屬于液-固吸附色譜，把吸附劑(如氧化鋁、硅膠)和粘合劑(如煅石膏、羧甲基纖維素鈉等)均勻地鋪在一塊玻璃板上形成薄層，將分離樣品滴加在薄層的一端，當(dāng)利用毛細(xì)作用使流動(dòng)相沿著吸附劑薄層(固定相)移動(dòng)時(shí)，吸附劑借各種分子間力(包括范德華力和氫鍵)作用于混合物中各組分，各組分以不同的作用強(qiáng)度被吸附。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)

被分離組分在固定相與流動(dòng)相之間進(jìn)行分配或吸附，經(jīng)過反復(fù)無數(shù)次的分配平衡或吸附平衡，不同組分的極性化合物就會(huì)在薄層板上移動(dòng)不同的距離。極性強(qiáng)的化合物會(huì)“粘”在極性的吸附劑上，在薄板上移動(dòng)的距離比較短。而非極性的物質(zhì)在薄層板上移動(dòng)較大的距離。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)

化合物移動(dòng)的距離大小用比移值（Rf值）表達(dá)，是介于0

1之間的數(shù)值。

比移值的定義為：組分遷移的距離與展開劑遷移的距離之比。

即：樣品原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離與樣品原點(diǎn)到溶劑前沿的距離之比。如圖所示。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)

薄層色譜常用的吸附劑或支持劑是硅膠或氧化鋁。

薄層色譜用的硅膠分為硅膠H不含粘合劑；

硅膠G含煅石膏做粘合劑；

硅膠HF-254含熒光物質(zhì)，可在波長(zhǎng)254nm紫外光下觀察熒光；

硅膠GF-254含有煅石膏和熒光劑。

薄層色譜用的氧化鋁也分為氧化鋁G、氧化鋁GF254及氧化鋁HF254。（一）薄層色譜原理薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)薄層色譜是紙色譜和柱色譜的結(jié)合，兼具二者的特點(diǎn)。①設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。只需一塊玻璃板和一個(gè)層析缸，即可進(jìn)行復(fù)雜混合物的定性與定量分析及分離制備。其原理與經(jīng)典柱色譜相同，但在敞開的薄層上操作，在檢查混合物的成分是否分開以及在顯色時(shí)都比較方便。（二）薄層色譜特點(diǎn)薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)②快速，展開時(shí)間短。薄層板比濾紙的毛細(xì)管作用大，因此展開速度快，薄層色譜一般只需十幾分鐘至幾十分鐘。③顯色方法選擇范圍寬。如對(duì)于無機(jī)物固定相，可采用腐蝕性的顯色劑。（二）薄層色譜特點(diǎn)薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)

④可以選用各種固定相。移動(dòng)相也可廣泛選用，比紙色譜有顯著的靈活性。

⑤斑點(diǎn)比較密集，檢出靈敏度較高。

⑥可適用于大型制備色譜。如增加薄層厚度，可增大樣品的處理量。（二）薄層色譜特點(diǎn)薄層色譜原理及特點(diǎn)—色譜分離技術(shù)

⑦展開機(jī)理和方式多種多樣。

⑧可適用于熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)藥物的分離，但不適用于揮發(fā)性藥物的分離。另外，對(duì)于成分太復(fù)雜的混合物，用薄層色譜法分離還是有困難的。（二）薄層色譜特點(diǎn)色譜分離技術(shù)--親和色譜的分離操作親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)大綱1.操作條件的選擇2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)吸附條件的選擇

吸附反應(yīng)條件最好是自然狀態(tài)下，配體與目的分子之間反應(yīng)的最佳條件；

注意控制流速，不能太快；

吸附時(shí)間的控制，延長(zhǎng)時(shí)間可促進(jìn)吸附；

進(jìn)樣量的大小控制，減少進(jìn)樣量，可提高吸附效果。1.操作條件的選擇親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（2）清洗條件的選擇。洗滌緩沖液的強(qiáng)度應(yīng)介于目的分子吸附條件與目的分子洗脫條件之間。（3）洗脫條件的選擇。在實(shí)際操作過程中，應(yīng)該在洗脫強(qiáng)度和耐受程度之間做好平衡。1.操作條件的選擇親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（1）樣品制備。一般地說，雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化方法以及流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、pH和溫度等因素有關(guān)。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)親和色譜樣品預(yù)處理的主要程序：①顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等的去除；②樣品的濃縮及除去蛋白酶或抑制劑。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（2）配基與目的物結(jié)合條件的選擇

配基與目的物的特異性結(jié)合需要適宜的pH、緩沖液鹽濃度和離子強(qiáng)度。pH不僅能調(diào)節(jié)配基的電荷基團(tuán)，也能調(diào)節(jié)目的物的電荷基團(tuán)。中等鹽濃度的緩沖液，能穩(wěn)定溶液中蛋白質(zhì)，并防止由于離子交換所引起的非特異性相互作用。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（3）柱操作

柱的大小取決于吸附劑的容量和所需純化的蛋白質(zhì)的量。一般地說，高的容量可以用于粗的短柱，大多數(shù)情況下，可以采用一次性的塑料小柱和1～5mL凝膠。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（4）流速的控制

提高流速可提高分離速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)下進(jìn)行，既要保證高速度，又要保證高效率。為了使純化蛋白能夠得到好的洗脫峰、最小的稀釋度和最大的回收率，最好使用低流速。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（5）清洗清洗過度會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物的損失增多，而清洗不充分則使洗脫回收的目標(biāo)產(chǎn)物純度降低。

具體操作是：樣品吸附在柱上之后，必須用幾倍體積的起始緩沖液對(duì)柱清洗以除去不結(jié)合的所有物質(zhì)。2.操作方法親和色譜的分離操作—色譜分離技術(shù)（7）柱的再生具體操作是用幾倍體積的起始緩沖液進(jìn)行再平衡，一般足以使親和柱再生，但一些未知的雜質(zhì)往往仍結(jié)合在柱上，必須用苛刻的條件才能除去。應(yīng)根據(jù)載體材料的不同、配基的性質(zhì)以及它與載體連接方式的不同，酌情處理。2.操作方法色譜分離技術(shù)--親和吸附劑的制備親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)大綱1.載體的選擇2.配基的選擇3.載體的活化與偶聯(lián)4.影響吸附劑親和力的因素親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)

親和色譜是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上，制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域與配體的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，具有高度的特異性和親和力。親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)①載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，以供與配基共價(jià)連接之用。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)③具有高度的水不溶性和親水性。④具有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由進(jìn)入⑤載體要有良好的機(jī)械性能，顆粒均勻。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)常用的親和色譜載體主要有：多孔玻璃載體；聚丙稀酰胺載體；纖維素載體；葡聚糖凝膠載體；瓊脂糖凝膠；交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。1.載體的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì)，可將其分為兩類：特殊配基和通用配基。親和層析中常用的特殊配基有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配基可適用于一類物質(zhì)的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基。2.配基的選擇親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)配基選擇時(shí)應(yīng)注意，所選配基應(yīng)只能識(shí)別被純化的目的物(配體)；

配體與配基應(yīng)該有足夠大的親和力；

配基與相應(yīng)目的物之間的結(jié)合應(yīng)具有可逆性；

配體具有足夠的穩(wěn)定性，能夠耐受反應(yīng)條件以及清洗合再生等。另外，配基的分子大小必須合適。2.配基的選擇親和層析純化蛋白親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)載體由于其相對(duì)的惰性，往往不能直接與配基連接，偶聯(lián)前一般需先活化，載體表面經(jīng)過活化后，產(chǎn)生的活性基團(tuán)可以在簡(jiǎn)單的化學(xué)條件下，與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團(tuán)，發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，這一過程稱為配基的鍵合。

載體表面的基團(tuán)必須具有通用性和高效性，可以與上述配基上的常見基團(tuán)發(fā)生簡(jiǎn)單、快速的反應(yīng)。3.載體的活化與偶聯(lián)親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)①配基濃度對(duì)于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。②空間障礙在制備有些吸附劑時(shí)需要在載體與配基之間插入一段適當(dāng)長(zhǎng)度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配基的活動(dòng)度并減輕載體的立體障礙。4.影響吸附劑親和力的因素親和吸附劑的制備—色譜分離技術(shù)③配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時(shí)，必須使它以最少的鍵與載體連接。④載體孔徑載體孔隙是配體向配基接近的運(yùn)動(dòng)通道，所以載體的孔徑大小對(duì)吸附劑的親和能力有決定性影響。4.影響吸附劑親和力的因素色譜分離技術(shù)--紙色譜紙色譜—色譜分離技術(shù)大綱1.紙色譜概念2.紙色譜操作紙色譜—色譜分離技術(shù)紙色譜是以濾紙為載體的分配色譜。

濾紙纖維一般能吸附25%～29%的水分，其中6%～7%的水分以氫鍵與纖維素結(jié)合。

紙色譜的固定相即為濾紙纖維及其結(jié)合水；

流動(dòng)相則為有機(jī)溶劑；

依據(jù)混合物中各組分在水相和有機(jī)相中的溶解度（分配系數(shù)）的不同，而實(shí)現(xiàn)各組分的分離。（一）紙色譜概念紙色譜示意圖紙色譜—色譜分離技術(shù)（1）點(diǎn)樣

將混合液（或溶于適當(dāng)溶劑的混合物）用玻璃毛細(xì)管或點(diǎn)樣器在濾紙上點(diǎn)樣。要求點(diǎn)樣點(diǎn)距紙底邊約2cm，每點(diǎn)間距約2cm，點(diǎn)的直徑一般小于0.5cm，也可點(diǎn)成3～5mm橫長(zhǎng)條。（二）紙