(高清版)GBT 40453-2021 柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法

GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofPhyllostictacitricarpa(McAlpine)Aa國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T40453—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。究院華北林業(yè)實驗中心、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所、湖南省植物保護研究所。1GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法本文件規(guī)定了柑橘黑斑病菌的檢疫鑒定方法。本文件適用于柑橘屬及其雜交種苗木和果實中柑橘黑斑病菌的分離檢測和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。SN/T2455進出境水果檢驗檢疫規(guī)程SN/T4648柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。Phyllostictinacitricarpa(McAlpine)Petrak,1953分類地位：真菌界(Fungi),子囊菌門(Ascomycota),盤菌亞門(Pezizomycotina),座囊菌綱(Do-thideomycetes),葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales),葉點霉科(Phyllostictaceae),葉點霉屬(Phyllostic-5方法原理征和實時熒光PCR特異性反應(yīng)進行鑒定。6儀器和用具2GB/T40453—20216.2用具7試劑和培養(yǎng)基Tris-HCl、EDTA、DNA提取試劑盒。7.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)和麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA),具體配制方法參見附錄B。8檢疫鑒定方法8.1現(xiàn)場檢疫柑橘屬及其雜交種生產(chǎn)與加工包裝基地檢疫按照SN/T4648進行，抽樣與取樣按照SN/T2455進行。8.2癥狀檢查似病斑，注意病斑上是否有黑色小顆粒狀分生孢子器，落葉上是否有黑褐色假囊殼。病菌為害癥狀參見附錄A。8.3鏡檢如有黑色小顆粒狀分生孢子器的病斑，置于體視顯微鏡下觀察記錄病斑和分生孢子器的形態(tài)、顏色及大小，對病斑組織進行徒手切片或冷凍切片，置于生物顯微鏡下觀察記錄分生孢子的形態(tài)特征，同時將分生孢子轉(zhuǎn)接到PDA平板上進行分離培養(yǎng)。如有黑褐色假囊殼的落葉，置于體視顯微鏡下觀察記錄假囊殼的形態(tài)特征，用接種針挑取假囊殼制8.4病菌分離未發(fā)現(xiàn)分生孢子器的病斑進行組織分離，在病健交界處剪成大小1mm×1mm組織塊，70%乙醇表面消毒30s或1%次氯酸鈉溶液表面消毒10min,無菌水洗滌3次，組織塊轉(zhuǎn)移至PDA平板上，置于22℃黑暗條件下培養(yǎng)5d～7d,發(fā)現(xiàn)疑似菌落，轉(zhuǎn)移邊緣菌絲至PDA平板上純化。3GB/T40453—20218.5實時熒光PCR檢測刮取疑似分離物菌絲或切取病果、葉片、枝條上的癥狀組織塊，用商品化試劑盒或改良的CTAB方法(見附錄C)提取DNA,并進行實時熒光PCR檢測。實時熒光PCR檢測方法按附錄C執(zhí)行。8.6形態(tài)學(xué)特征觀察將實時熒光PCR檢測結(jié)果為陽性的分離物分別轉(zhuǎn)接至PDA、OA、MEA平板上，置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)14d。培養(yǎng)3d后開始觀察記錄PDA平板上菌落形態(tài)，7d后體視顯微鏡下觀察分生孢子器產(chǎn)生情況，10d后生物顯微鏡下觀察測量分生孢子的形態(tài)和大小、膠質(zhì)鞘厚度、尾端附屬絲長度；觀察記錄OA平板上是否產(chǎn)生黃色色素以及MEA平板上菌落形態(tài)、顏色。9.1形態(tài)學(xué)特征PDA上初生菌落白色、平鋪狀，菌絲致密。后期菌落中央開始變?yōu)榛议蠙焐诨疑梁谏?，逐漸明區(qū)域。7d后菌落上形成黑色隆起的硬塊狀子座，炭色顆粒狀分生孢子器。分生孢子器半埋生，10d~14d后成熟，從中溢出乳白色黏性分生孢子團，內(nèi)含大量分生孢子。OA上常產(chǎn)生擴散性黃色素。MEA上菌落中央黑橄欖色，邊緣灰白色(參見附錄A)。8.5μm),外覆蓋一層透明的膠質(zhì)鞘，膠質(zhì)鞘厚度通常小于1.5μm,尾端常有一條無色膠狀物形成的附屬絲，長度4μm～10μm,膠質(zhì)鞘及附屬絲遇水均易溶化。培養(yǎng)狀態(tài)及寄主落葉上，病菌有時可見小型9.2與近似種的區(qū)別柑橘黑斑病菌與近似種的區(qū)別主要表現(xiàn)在分生孢子大小、膠質(zhì)鞘厚度、附屬絲長度等形態(tài)特征以及在培養(yǎng)基OA、MEA上培養(yǎng)性狀等方面(參見附錄A和附錄D)。其中，OA上柑橘黑斑病菌和P.paracitricarpa菌落常產(chǎn)生黃色色素擴散至菌落周圍的培養(yǎng)基中，其他近似種菌落不會產(chǎn)生黃色素。MEA上P.paracitricarpa菌落中央由黃色逐漸變成淺橄欖色，邊緣黃色；柑橘黑斑病菌和其他近似種4GB/T40453—2021病菌形態(tài)學(xué)特征與9.1.1、9.1.2描述相符合，且實時熒光PCR檢測為陽性，判定檢出柑橘黑斑病菌。樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。陽性樣品應(yīng)保存高壓滅菌后方可處理。陽性分離物應(yīng)妥善保存，將菌絲塊轉(zhuǎn)入30%滅菌甘油中于-80℃下保存，或在PDA平板培養(yǎng)后于4℃下保存，每90d定期轉(zhuǎn)接。保存期滿后高壓滅菌處理。5GB/T40453—2021(資料性)A.1寄主范圍均感病。其中檸檬(C.limon)最易感病。A.2分布A.3傳播方式A.4為害癥狀A(yù).4.1果實癥狀病斑外圍有黃色或綠色的暈圈。病斑中央凹陷，灰色至棕褐色，通常會產(chǎn)生凸起的黑色小顆粒(分生孢子器)。硬斑型癥狀參見圖A.1。A.4.1.2黑星型顆粒(分生孢子器)。黑星型斑癥狀常在果實近成熟時表現(xiàn)，并常出現(xiàn)在硬斑周圍。黑星型癥狀參見圖6GB/T40453—2021A.1。A.4.1.3假黑點型通常發(fā)生在綠色果實上，呈小型凸起的深褐色至黑色病斑，周圍常有深色小斑點，無黑色小顆粒(分生孢子器)。黑星型癥狀參見圖A.1。A.4.1.4毒斑型生長末期果實被嚴(yán)重侵染時，多個病斑聯(lián)合形成凹陷不規(guī)則的紅褐色至黑色大病斑。在高濕條件下會產(chǎn)生大量黑色小顆粒(分生孢子器),且病斑發(fā)展很快，可深入果皮內(nèi)，很快蔓延至整個果實，引起全果腐爛。毒斑型癥狀參見圖A.1。A.4.2葉片及枝條癥狀葉片癥狀與果實上硬斑型病斑類似，常發(fā)生在老葉上，通常圓形、直徑可達3mm,病斑中央稍凹陷，灰白或淺褐色，常有黑色小顆粒(分生孢子器),邊緣深褐色至黑色，有黃色暈圈。枝條上的病斑癥狀與葉片上類似。葉片癥狀參見圖A.2。a)硬斑型癥狀b)黑星型癥狀注：a)引自Wangetal.(2012);b)～d)引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-diseases/citrus/citrus-black-spot/citrus-black-spot。圖A.1為害果實癥狀GB/T40453—2021注：引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-圖A.2為害葉片癥狀圖A.3病菌形態(tài)學(xué)特征78GB/T40453—2021圖A.3(續(xù))圖A.4MEA上P.citriarpa和P.paracitricarpa菌落特征9GB/T40453—2021(資料性)培養(yǎng)基B.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)200g馬鈴薯去皮切成小塊后加水煮沸30min,雙層紗布過濾后加入20g葡萄糖、18g瓊脂，繼續(xù)煮至瓊脂完全溶化后加蒸餾水補足1000mL,121℃下滅菌15min。也可采用商品化PDA培養(yǎng)基按使用說明進行配制。B.2燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)稱取30g燕麥片放入紗布中，加水慢煮2h,用紗布擠壓過濾，加入20g瓊脂，繼續(xù)煮至瓊脂完全溶化后加蒸餾水補足1000mL,在121℃下滅菌15min。也可采用商品化OA培養(yǎng)基按使用說明進行B.3麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA)稱取麥芽膏或麥芽汁粉30g,瓊脂15g,加蒸餾水加熱溶解，完全溶化后加蒸餾水補足1000mL,在121℃下滅菌15min。也可采用商品化MEA培養(yǎng)基按使用說明進行配制。GB/T40453—2021(規(guī)范性)實時熒光PCR檢測方法500μLCTAB緩沖液和0.1g蛋白酶K,混勻，65℃水浴1h,13000g離心5min～10min,保留上清放置1h,或-20℃過夜；13000g離心10min,可見DNA沉淀；加1mL70%乙醇清洗DNA沉淀2保存于-20℃下備用。也可選用商用植物組織DNA提取試劑盒。PCR級DNA溶液的OD?5o/OD?so比值應(yīng)為1.7～1.9。C.2實時熒光PCRC.2.1引物及探針引物為Gc-F2(5'-aggtgatggaagggaggcctt-3')/Gc-R2(5'-caggcgtcctggcctagag-3′),探針為Gc-P(5'-FAM-aaaaagccgcccgacctaccttca-TAMRA-3′)。C.2.2反應(yīng)體系和程序柑橘黑斑病菌DNA作陽性對照、不含柑橘黑斑病菌DC.2.3結(jié)果判定疑似分離物：出現(xiàn)典型擴增曲線判定為陽性；無典型擴增曲線判定為陰性。樣品檢測：出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤35,判定為陽性；35≤Ct值≤40,增加DNA用量2～10倍病菌分離。病菌與近似種的區(qū)別見表D.1。學(xué)名P.citricarpaP.capitalensisP.citriasianaP.citrimaxima分布非洲、亞洲、澳大利亞，以及北美和南美部分地區(qū)世界廣泛分布中國、泰國、越南巴西中國泰國意大利、西班牙希臘寄主柑橘屬植物(柚、波斯青檸除外)及其雜交種柑橘屬植物和其它非柑橘屬植物蜜柚和沙田柚檸檬蜜桔、柚、甜橙和檸檬柚柑橘屬植物檸檬、甜橙致病性具致病性內(nèi)生菌，無致病性或弱致病性具致病性內(nèi)生菌無致病性無致病性或弱致病性具致病性無致病性或弱致病性具致病性癥狀硬斑型、黑星型、型病斑無癥狀或產(chǎn)生小病斑與P.citricarpa癥狀相似，果皮病斑上可產(chǎn)生分生孢子器無癥狀癥狀輕微，為害葉片和果實，病斑上子器柚果皮上產(chǎn)生棕色病斑無癥狀從落葉中分離，接種到甜橙果實carpa相似分生孢子平均大小/μm(11～13)×(7~膠質(zhì)鞘厚度/μm11附屬絲長度/μm4～104～10未知小型分生孢子大小/μm未知未知未知未知表D.1(續(xù))學(xué)名P.citricarpaP.citriasianaP.citrichinaensisP.citrimarima假囊殼僅在落葉產(chǎn)生，新鮮葉片、果實及培養(yǎng)基上不會產(chǎn)生在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知未知在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知小/μm未知未知未知未知色素產(chǎn)生(OA)產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素產(chǎn)生黃色素菌落特征(MEA)菌落中央黑橄欖色，邊緣灰白色、菌落表面黑褐色，邊緣羽狀菌落暗褐色，邊緣棕褐色未知菌落橄欖綠色，表面有多個環(huán)形隆起，邊緣有裂刻黑色綠色菌落中央由黃色逐漸變成淺橄欖不規(guī)則裂瓣狀Wikeeetal.(2013);P.paracaitalensis和P.paracitricarpa相關(guān)信息引自Guarnacciaetal.(2017)。GB/T40453—2021[1]AaHAvander.StudiesinPhyllostictaI.StudiesinMycology,1973,5:1-110.[2]BaayenRP,BonantsPJM,VerkleyG,etal.Nonpathogenicisolatesofthecitrusblackspotfungus,Guignardiacitricarpa,identifiedasacosmopolitanendophyteofwoodyplants,G.mangif-erae(Phyllostictacapitalensis).Phytopathology,2002,92:464-477.[3]EPPO.PM7/17(2):Guignardiacitricarpa.EPPOBulletin,2009,39(3):318-327.[4]EPPO.PM7/17.Diagnosticprotocolsforregulatedpests:Phyllostictacitricarpa[underrevision].2020./standards/PM7/17[5]FAO(2016)ISPM27.DiagnosticprotocolsforregulatedpestsDP5:PhyllostictaCitri-carpa(McAlpine)Aaonfruit.InternationalPlantProtectionConvention(IPPC),FAO,Rome.[6]GlienkeC,PereiraOL,StringariD,etal.EndophyticandpathogenicPhyllostictaspecies,withreferencetothoseassociatedwithCitrusBlackSpot.Persoonia,2011,26:47-56.[7]GuarnacciaV,GroenewaldJZ,LiH,etal.FirstreportofPhyllostictacitricarpaandde-scriptionoftwonewspecies,P.paracapitalensisandP.paracitricarpa,fromcitrusinEurope.StudiesinMycology,2017,87:161-185.[8]NAPPO.PhytosanitaryAlertSystem:Confirmationofcitrusblackspot(Guignardiacitricarpa)inFlorida-UnitedStates.NAPPO,2010./oprDetail.cfm?oprID=421.[9]SchirmacherAM,TomlinsonJA,BarnesAV,etal.Species-specificreal-timePCRfordi-agnosisofPhyllostictacitricarpaonCitrusspecies.EPPOBulletin,2019,49:306-313.[10]SuttonBC&.WaterstonJM.Guignardiacitricarpa.CMIdescriptionsofpathogenicfungiandbacteri