(高清版)GBT 40453-2021 柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法

GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofPhyllostictacitricarpa(McAlpine)Aa國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40453—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所、湖南省植物保護(hù)研究所。1GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法本文件規(guī)定了柑橘黑斑病菌的檢疫鑒定方法。本文件適用于柑橘屬及其雜交種苗木和果實(shí)中柑橘黑斑病菌的分離檢測(cè)和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。SN/T2455進(jìn)出境水果檢驗(yàn)檢疫規(guī)程SN/T4648柑橘黑斑病菌檢疫鑒定方法本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。Phyllostictinacitricarpa(McAlpine)Petrak,1953分類(lèi)地位：真菌界(Fungi),子囊菌門(mén)(Ascomycota),盤(pán)菌亞門(mén)(Pezizomycotina),座囊菌綱(Do-thideomycetes),葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales),葉點(diǎn)霉科(Phyllostictaceae),葉點(diǎn)霉屬(Phyllostic-5方法原理征和實(shí)時(shí)熒光PCR特異性反應(yīng)進(jìn)行鑒定。6儀器和用具2GB/T40453—20216.2用具7試劑和培養(yǎng)基Tris-HCl、EDTA、DNA提取試劑盒。7.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)和麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA),具體配制方法參見(jiàn)附錄B。8檢疫鑒定方法8.1現(xiàn)場(chǎng)檢疫柑橘屬及其雜交種生產(chǎn)與加工包裝基地檢疫按照SN/T4648進(jìn)行，抽樣與取樣按照SN/T2455進(jìn)行。8.2癥狀檢查似病斑，注意病斑上是否有黑色小顆粒狀分生孢子器，落葉上是否有黑褐色假囊殼。病菌為害癥狀參見(jiàn)附錄A。8.3鏡檢如有黑色小顆粒狀分生孢子器的病斑，置于體視顯微鏡下觀察記錄病斑和分生孢子器的形態(tài)、顏色及大小，對(duì)病斑組織進(jìn)行徒手切片或冷凍切片，置于生物顯微鏡下觀察記錄分生孢子的形態(tài)特征，同時(shí)將分生孢子轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。如有黑褐色假囊殼的落葉，置于體視顯微鏡下觀察記錄假囊殼的形態(tài)特征，用接種針挑取假囊殼制8.4病菌分離未發(fā)現(xiàn)分生孢子器的病斑進(jìn)行組織分離，在病健交界處剪成大小1mm×1mm組織塊，70%乙醇表面消毒30s或1%次氯酸鈉溶液表面消毒10min,無(wú)菌水洗滌3次，組織塊轉(zhuǎn)移至PDA平板上，置于22℃黑暗條件下培養(yǎng)5d～7d,發(fā)現(xiàn)疑似菌落，轉(zhuǎn)移邊緣菌絲至PDA平板上純化。3GB/T40453—20218.5實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)刮取疑似分離物菌絲或切取病果、葉片、枝條上的癥狀組織塊，用商品化試劑盒或改良的CTAB方法(見(jiàn)附錄C)提取DNA,并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法按附錄C執(zhí)行。8.6形態(tài)學(xué)特征觀察將實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的分離物分別轉(zhuǎn)接至PDA、OA、MEA平板上，置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)14d。培養(yǎng)3d后開(kāi)始觀察記錄PDA平板上菌落形態(tài)，7d后體視顯微鏡下觀察分生孢子器產(chǎn)生情況，10d后生物顯微鏡下觀察測(cè)量分生孢子的形態(tài)和大小、膠質(zhì)鞘厚度、尾端附屬絲長(zhǎng)度；觀察記錄OA平板上是否產(chǎn)生黃色色素以及MEA平板上菌落形態(tài)、顏色。9.1形態(tài)學(xué)特征PDA上初生菌落白色、平鋪狀，菌絲致密。后期菌落中央開(kāi)始變?yōu)榛议蠙焐?，黑灰色至黑色，逐漸明區(qū)域。7d后菌落上形成黑色隆起的硬塊狀子座，炭色顆粒狀分生孢子器。分生孢子器半埋生，10d~14d后成熟，從中溢出乳白色黏性分生孢子團(tuán)，內(nèi)含大量分生孢子。OA上常產(chǎn)生擴(kuò)散性黃色素。MEA上菌落中央黑橄欖色，邊緣灰白色(參見(jiàn)附錄A)。8.5μm),外覆蓋一層透明的膠質(zhì)鞘，膠質(zhì)鞘厚度通常小于1.5μm,尾端常有一條無(wú)色膠狀物形成的附屬絲，長(zhǎng)度4μm～10μm,膠質(zhì)鞘及附屬絲遇水均易溶化。培養(yǎng)狀態(tài)及寄主落葉上，病菌有時(shí)可見(jiàn)小型9.2與近似種的區(qū)別柑橘黑斑病菌與近似種的區(qū)別主要表現(xiàn)在分生孢子大小、膠質(zhì)鞘厚度、附屬絲長(zhǎng)度等形態(tài)特征以及在培養(yǎng)基OA、MEA上培養(yǎng)性狀等方面(參見(jiàn)附錄A和附錄D)。其中，OA上柑橘黑斑病菌和P.paracitricarpa菌落常產(chǎn)生黃色色素?cái)U(kuò)散至菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基中，其他近似種菌落不會(huì)產(chǎn)生黃色素。MEA上P.paracitricarpa菌落中央由黃色逐漸變成淺橄欖色，邊緣黃色；柑橘黑斑病菌和其他近似種4GB/T40453—2021病菌形態(tài)學(xué)特征與9.1.1、9.1.2描述相符合，且實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，判定檢出柑橘黑斑病菌。樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。陽(yáng)性樣品應(yīng)保存高壓滅菌后方可處理。陽(yáng)性分離物應(yīng)妥善保存，將菌絲塊轉(zhuǎn)入30%滅菌甘油中于-80℃下保存，或在PDA平板培養(yǎng)后于4℃下保存，每90d定期轉(zhuǎn)接。保存期滿后高壓滅菌處理。5GB/T40453—2021(資料性)A.1寄主范圍均感病。其中檸檬(C.limon)最易感病。A.2分布A.3傳播方式A.4為害癥狀A(yù).4.1果實(shí)癥狀病斑外圍有黃色或綠色的暈圈。病斑中央凹陷，灰色至棕褐色，通常會(huì)產(chǎn)生凸起的黑色小顆粒(分生孢子器)。硬斑型癥狀參見(jiàn)圖A.1。A.4.1.2黑星型顆粒(分生孢子器)。黑星型斑癥狀常在果實(shí)近成熟時(shí)表現(xiàn)，并常出現(xiàn)在硬斑周?chē)?。黑星型癥狀參見(jiàn)圖6GB/T40453—2021A.1。A.4.1.3假黑點(diǎn)型通常發(fā)生在綠色果實(shí)上，呈小型凸起的深褐色至黑色病斑，周?chē)Ｓ猩钌“唿c(diǎn)，無(wú)黑色小顆粒(分生孢子器)。黑星型癥狀參見(jiàn)圖A.1。A.4.1.4毒斑型生長(zhǎng)末期果實(shí)被嚴(yán)重侵染時(shí)，多個(gè)病斑聯(lián)合形成凹陷不規(guī)則的紅褐色至黑色大病斑。在高濕條件下會(huì)產(chǎn)生大量黑色小顆粒(分生孢子器),且病斑發(fā)展很快，可深入果皮內(nèi)，很快蔓延至整個(gè)果實(shí)，引起全果腐爛。毒斑型癥狀參見(jiàn)圖A.1。A.4.2葉片及枝條癥狀葉片癥狀與果實(shí)上硬斑型病斑類(lèi)似，常發(fā)生在老葉上，通常圓形、直徑可達(dá)3mm,病斑中央稍凹陷，灰白或淺褐色，常有黑色小顆粒(分生孢子器),邊緣深褐色至黑色，有黃色暈圈。枝條上的病斑癥狀與葉片上類(lèi)似。葉片癥狀參見(jiàn)圖A.2。a)硬斑型癥狀b)黑星型癥狀注：a)引自Wangetal.(2012);b)～d)引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-diseases/citrus/citrus-black-spot/citrus-black-spot。圖A.1為害果實(shí)癥狀GB/T40453—2021注：引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-圖A.2為害葉片癥狀圖A.3病菌形態(tài)學(xué)特征78GB/T40453—2021圖A.3(續(xù))圖A.4MEA上P.citriarpa和P.paracitricarpa菌落特征9GB/T40453—2021(資料性)培養(yǎng)基B.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)200g馬鈴薯去皮切成小塊后加水煮沸30min,雙層紗布過(guò)濾后加入20g葡萄糖、18g瓊脂，繼續(xù)煮至瓊脂完全溶化后加蒸餾水補(bǔ)足1000mL,121℃下滅菌15min。也可采用商品化PDA培養(yǎng)基按使用說(shuō)明進(jìn)行配制。B.2燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)稱取30g燕麥片放入紗布中，加水慢煮2h,用紗布擠壓過(guò)濾，加入20g瓊脂，繼續(xù)煮至瓊脂完全溶化后加蒸餾水補(bǔ)足1000mL,在121℃下滅菌15min。也可采用商品化OA培養(yǎng)基按使用說(shuō)明進(jìn)行B.3麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA)稱取麥芽膏或麥芽汁粉30g,瓊脂15g,加蒸餾水加熱溶解，完全溶化后加蒸餾水補(bǔ)足1000mL,在121℃下滅菌15min。也可采用商品化MEA培養(yǎng)基按使用說(shuō)明進(jìn)行配制。GB/T40453—2021(規(guī)范性)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法500μLCTAB緩沖液和0.1g蛋白酶K,混勻，65℃水浴1h,13000g離心5min～10min,保留上清放置1h,或-20℃過(guò)夜；13000g離心10min,可見(jiàn)DNA沉淀；加1mL70%乙醇清洗DNA沉淀2保存于-20℃下備用。也可選用商用植物組織DNA提取試劑盒。PCR級(jí)DNA溶液的OD?5o/OD?so比值應(yīng)為1.7～1.9。C.2實(shí)時(shí)熒光PCRC.2.1引物及探針引物為Gc-F2(5'-aggtgatggaagggaggcctt-3')/Gc-R2(5'-caggcgtcctggcctagag-3′),探針為Gc-P(5'-FAM-aaaaagccgcccgacctaccttca-TAMRA-3′)。C.2.2反應(yīng)體系和程序柑橘黑斑病菌DNA作陽(yáng)性對(duì)照、不含柑橘黑斑病菌DC.2.3結(jié)果判定疑似分離物：出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性；無(wú)典型擴(kuò)增曲線判定為陰性。樣品檢測(cè)：出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35,判定為陽(yáng)性；35≤Ct值≤40,增加DNA用量2～10倍病菌分離。病菌與近似種的區(qū)別見(jiàn)表D.1。學(xué)名P.citricarpaP.capitalensisP.citriasianaP.citrimaxima分布非洲、亞洲、澳大利亞，以及北美和南美部分地區(qū)世界廣泛分布中國(guó)、泰國(guó)、越南巴西中國(guó)泰國(guó)意大利、西班牙希臘寄主柑橘屬植物(柚、波斯青檸除外)及其雜交種柑橘屬植物和其它非柑橘屬植物蜜柚和沙田柚檸檬蜜桔、柚、甜橙和檸檬柚柑橘屬植物檸檬、甜橙致病性具致病性內(nèi)生菌，無(wú)致病性或弱致病性具致病性內(nèi)生菌無(wú)致病性無(wú)致病性或弱致病性具致病性無(wú)致病性或弱致病性具致病性癥狀硬斑型、黑星型、型病斑無(wú)癥狀或產(chǎn)生小病斑與P.citricarpa癥狀相似，果皮病斑上可產(chǎn)生分生孢子器無(wú)癥狀癥狀輕微，為害葉片和果實(shí)，病斑上子器柚果皮上產(chǎn)生棕色病斑無(wú)癥狀從落葉中分離，接種到甜橙果實(shí)carpa相似分生孢子平均大小/μm(11～13)×(7~膠質(zhì)鞘厚度/μm11附屬絲長(zhǎng)度/μm4～104～10未知小型分生孢子大小/μm未知未知未知未知表D.1(續(xù))學(xué)名P.citricarpaP.citriasianaP.citrichinaensisP.citrimarima假囊殼僅在落葉產(chǎn)生，新鮮葉片、果實(shí)及培養(yǎng)基上不會(huì)產(chǎn)生在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知未知在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知在培養(yǎng)基上產(chǎn)生未知小/μm未知未知未知未知色素產(chǎn)生(OA)產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素不產(chǎn)生黃色素產(chǎn)生黃色素菌落特征(MEA)菌落中央黑橄欖色，邊緣灰白色、菌落表面黑褐色，邊緣羽狀菌落暗褐色，邊緣棕褐色未知菌落橄欖綠色，表面有多個(gè)環(huán)形隆起，邊緣有裂刻黑色綠色菌落中央由黃色逐漸變成淺橄欖不規(guī)則裂瓣?duì)頦ikeeetal.(2013);P.paracaitalensis和P.paracitricarpa相關(guān)信息引自Guarnacciaetal.(2017)。GB/T40453—2021[1]AaHAvander.StudiesinPhyllostictaI.StudiesinMycology,1973,5:1-110.[2]BaayenRP,BonantsPJM,VerkleyG,etal.Nonpathogenicisolatesofthecitrusblackspotfungus,Guignardiacitricarpa,identifiedasacosmopolitanendophyteofwoodyplants,G.mangif-erae(Phyllostictacapitalensis).Phytopathology,2002,92:464-477.[3]EPPO.PM7/17(2):Guignardiacitricarpa.EPPOBulletin,2009,39(3):318-327.[4]EPPO.PM7/17.Diagnosticprotocolsforregulatedpests:Phyllostictacitricarpa[underrevision].2020./standards/PM7/17[5]FAO(2016)ISPM27.DiagnosticprotocolsforregulatedpestsDP5:PhyllostictaCitri-carpa(McAlpine)Aaonfruit.InternationalPlantProtectionConvention(IPPC),FAO,Rome.[6]GlienkeC,PereiraOL,StringariD,etal.EndophyticandpathogenicPhyllostictaspecies,withreferencetothoseassociatedwithCitrusBlackSpot.Persoonia,2011,26:47-56.[7]GuarnacciaV,GroenewaldJZ,LiH,etal.FirstreportofPhyllostictacitricarpaandde-scriptionoftwonewspecies,P.paracapitalensisandP.paracitricarpa,fromcitrusinEurope.StudiesinMycology,2017,87:161-185.[8]NAPPO.PhytosanitaryAlertSystem:Confirmationofcitrusblackspot(Guignardiacitricarpa)inFlorida-UnitedStates.NAPPO,2010./oprDetail.cfm?oprID=421.[9]SchirmacherAM,TomlinsonJA,BarnesAV,etal.Species-specificreal-timePCRfordi-agnosisofPhyllostictacitricarpaonCitrusspecies.EPPOBulletin,2019,49:306-313.[10]SuttonBC&.WaterstonJM.Guignardiacitricarpa.CMIdescriptionsofpathogenicfungiandbacteri