蛋白質(zhì)復(fù)性方法及其注意事項

蛋白質(zhì)復(fù)性方法及其注意事項蛋白前期準(zhǔn)備（1）查閱目標(biāo)蛋白相關(guān)文獻(xiàn)，了解其等電點，標(biāo)簽等注意點。（2）如果目標(biāo)蛋白易降解，可在純化時加1-2mMDTT，全程低溫，及時處理。（3）透析Buffer的選擇可參考文獻(xiàn)。蛋白復(fù)性包涵體：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。在E.coli中累積的重組蛋白會迅速地以包涵體形式被沉淀出來，這些包涵體蛋白是喪失生物活性的不可溶的錯誤折疊蛋白的聚集體。包涵體的處理一般包括這么幾步：包涵體的洗滌、溶解、純化及復(fù)性。如果過表達(dá)蛋白在包涵體中，那么通常有兩個選擇可以考慮：（1）退一步，優(yōu)化表達(dá)條件；（2）接受包涵體并采取策略來將蛋白溶解以及復(fù)性。這里主要考慮第二種方案。包涵體的洗滌

破碎細(xì)胞都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入蛋白酶抑制劑等，還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。洗滌Buffer：50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,2mMDTT，150mMNaCl,1%TritonX-100,1mg/mlLeupeptin,1mg/mlPepstatin,1mMTCEP。超聲時用40-60ml裂解液,因為我們的超聲儀很適合用100ml小燒杯,裝40-60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會灑出來.菌多就延長超聲時間（全程冰?。?。

包涵體的溶解1、對于尿素和鹽酸胍的選擇：尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。

2、去垢劑：溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。包涵體的復(fù)性1復(fù)性：通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。2復(fù)性的效率：復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。4、復(fù)性中常采用的方法有：稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，缺點是易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺例如復(fù)性Buffer：50mMTris-HCl(pH8.0)，10mMCaCl2，0.4ML-Arg,2mMGSH/0.4mMGSSG,10%甘油。透析buffer：50mMTris-HCl(pH8.0)，10mMCaCl2，2mMDTT,10%甘油。復(fù)性中蛋白析出！出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和pH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)包涵體的溶液成分，每隔1個pH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。（1）

蛋白析出最大的可能性：蛋白濃度太高，建議稀釋以后再復(fù)性；（2）透析的鹽濃度（比如urea）要平緩降低：8M-6M-2M-PBS；(3）若加變性劑（尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M）；（4）另外可將甘油濃度增加（范圍可在≤30%），且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；

（5）如果還不行，可以換新的復(fù)性緩沖液

；（6）純度不夠！出現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白純度不夠時，可以先過分子篩再復(fù)性；帶有二硫鍵蛋白的復(fù)性！如果蛋白中存在兩個以上的半胱氨酸，立即形成正確的二硫鍵是不可能的。隨著二硫鍵的數(shù)目增加（分子間與分子內(nèi)的），可能的組合數(shù)目也在劇烈上升（3個二硫鍵就是15種可能組合，4個對應(yīng)105，5個對應(yīng)945等等）。如果二硫鍵是正確折疊所必須的話，應(yīng)該在溶解時加入一種還原性試劑（如1－10mMDTT）。這種還原性試劑能夠被復(fù)性用二硫化物置換試劑所取代。加入二硫