GB∕T 40903-2021 紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物

紡織品DNA分析法鑒別某些特種動物纖維Textiles—IdentificationofsomeanCashmere,wool,yakandthei 國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準化管理委員會 I 1 2 26設(shè)備和儀器 2 3 4 410驗證 711結(jié)果判定 812精密度 913試驗報告 9 附錄B(資料性)額外的DNA純化 附錄C(資料性)等效的DNA抽提方法 附錄D(資料性)各類紡織產(chǎn)品的應(yīng)用實例 附錄E(資料性)方法重復(fù)性和再現(xiàn)性 I——第3章對應(yīng)ISO——第4章對應(yīng)ISO——第5章對應(yīng)ISO18074:2015中的第3章；18074:2015中的第4章；18074:2015中的第5章；18074:2015中的第2章；●用修改采用國際標(biāo)準的GB/T6682代替了ISO36Ⅱ12PCR擴增DNA聚合酶DNApolymeraseforPCRmethod與山羊絨線粒體DNA序列一致的引物。與綿羊毛線粒體DNA序列一致的引物。與牦牛絨線粒體DNA序列一致的引物。4原理通過化學(xué)和酶的處理抽提出動物纖維中的DNA,經(jīng)離心沉淀對DNA進行純化。分別使用山羊5注意DNA分析的鑒別結(jié)果在樣品染色處理程度較輕或是淺色染色的情況下有著很高的準確性。當(dāng)紡織產(chǎn)品經(jīng)過深度加工或高溫處理時，線粒體DNA可能遭到破壞。在此情況下，由于PCR擴增受到抑制，使鑒別產(chǎn)生一定的困難。紡織產(chǎn)品如受別的物種污染，比如綿6.1微量移液器及吸頭：能夠準確移取(0～20)μL(±0.20μL),(20～200)μL(±1.60μL),(200~3——500mmol/LEDTA(7.5),2mL; NaCl,170mg; 459.4DNA純化9.4.7將超濾離心裝置于4℃,14000g離心12min。6引物名稱引物序列山羊絨下游下游下游通用下游 ——MgCl?,1.5mmol。7溫度/時間1擴增最后的延伸11將凝膠置于可密封塑料盒(6.12)中。加入含有EB的溶液100mL,將凝膠在溶液中浸染8在9.3描述的DNA抽提過程不投入動物纖維，即DNA反應(yīng)溶液中無樣品DNA。每批試驗均需性對照。每次試驗均需完成一次添加動物纖維的抽提擴增。該驗證可觀察到PCR擴增。當(dāng)10.3所述陽性對照未出現(xiàn)擴增片段時，進行本操作。在PCR反應(yīng)體系中加入指定的單個陽性當(dāng)10.2所述陰性對照出現(xiàn)了陽性條帶時，進行本操作。PCR反應(yīng)液中不加DNA,應(yīng)觀察不到若動物纖維的試驗結(jié)果為陰性，則將DNA標(biāo)準引物及相應(yīng)的DNA加入反應(yīng)體系中進行PCR擴PCR反應(yīng)溶液樣品DNA加入反應(yīng)DNA加入反應(yīng)纖維制樣否是否否否是是否否否是是否否否擴增是是是是是檢測是是是是是——當(dāng)反應(yīng)體系不含DNA(10.2和10.5)發(fā)生了擴增時，此次試驗不可信；當(dāng)驗證試驗中有加入特定片段應(yīng)通過與其參照遷移DNAmarker的信號強度比較來判定。9——當(dāng)驗證試驗完全正常時，可通過特定動物引物是否引起DNA擴增產(chǎn)物來確定動物纖維的DNA不提取，DNA提取，纖維樣品擴增不擴增擴增擴增不擴增擴增不擴增不擴增擴增擴增不擴增擴增者未擴增的擴增可信不擴增不擴增 擴增—不擴增a)采用的文件編號；c)聚合酶及PCR的反應(yīng)條件；d)產(chǎn)品組分的測定結(jié)果；e)其他偏離所述操作的詳細說明。DNA擴增經(jīng)歷以下步驟。每經(jīng)過一個完整的PCR循環(huán)DNA片段就會倍增。如圖A.1的圖文表A.2.1第0步：加熱使DNA螺旋雙鏈打開成為兩條單鏈。反應(yīng)中起到引發(fā)和有選擇性地引導(dǎo)單核苷酸復(fù)制成為新的DNA鏈。DNA片段的長度由這一步驟A.2.3第2步：兩種擴增同時在這一步發(fā)生：1)第1步的擴增；2)另一種擴增。另一種擴增是以第1步A.2.4第3步：第1步和第2步的擴增繼續(xù)進行。擴增產(chǎn)生了大量長度由兩端引物決定的新的DNAA.2.5第4步：第1步、第2步、第3步繼續(xù)重復(fù)進行。最主要的擴增發(fā)生在兩端由引物決定長度的圖A.1DNA片段的PCR擴增過程B.2DNA純化方法C.3.1蛋白酶K溶液：稱取180mg蛋白酶(>30單位/mg),溶于10mL水中，分裝后置于-20℃——CTAB(C.3.3),2g;———0.5mol/LEDTA(C.3.4),40mL;C.4.2將離心管置于56℃振蕩攪拌器(C.2.3),以500r/min的速度振蕩過夜(至少8h)。標(biāo)簽標(biāo)有山羊絨的染色產(chǎn)品購自市場。這些樣品同時進行了顯微鏡檢測和DNA分析，O表示檢出。結(jié)果見表D.1。表D.1實際樣品的DNA分析結(jié)果顯微鏡觀察山羊絨山羊絨1O2OO3紫色針織OO4OO5OOOOO6OOOOOO7黑色針織OOO8OOO9OOOOOOOOO黑色毛氈OOOOOOOOOOOOOO黑色針織OO(弱)OO(弱)OOOOO黑色針織OO黑色針織OOOOOOOO黑灰針織OOOOE.1重復(fù)性E.1.1.1樣品E.1.2.2聚合酶及PCR條件MM陽性對照E.1.3.2聚合酶及PCR條件MM陰性對照特異性條帶一E.3再現(xiàn)性E.3.1試驗樣品所用的樣品即為E.1中使用的100%樣品。E.3.2實驗室E.3.3試驗結(jié)果使用每種動物纖維的引物分別對4個樣品及1個陰性對照進行測試。表E.1顯示與期待的試驗結(jié)引物樣品山羊絨綿羊毛陰性對照山羊絨綿羊毛織物A為一塊黑色50%山羊絨/50%綿[1]GB/T6529紡織品調(diào)濕和試驗用標(biāo)準大氣(GB/T6529—2008,ISO139:2005,MOD)[2]GB/T11951天然纖維術(shù)語(GB/T11951—2018,ISO6938:2012,MOD)[3]GB/T36433紡織品山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析熒光PCR法[5]Ausubel,F.M.;Brent,R.;Kingston,R.E.;Moore,E.E.;SeidmaK.CurrentProtocolsinM