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文檔簡介

摘要作為基因傳遞的載體,質粒DNA已被廣泛應用于DNA疫苗和基因治療。質粒DNA存在不同的構型,其中超螺旋構型的質粒在細胞中的轉染和表達效率最高。美國食品與藥品監(jiān)督管理局在2007年發(fā)布了質粒DNA疫苗的工藝指導原則,建議超螺旋構型的比例大于80%,因此建立高靈敏度和高分辨率的方法用于質粒DNA構型分離和分析具有重要意義。本文就近年來質粒DNA構型的分離和分析方法進行了綜述,主要包括瓊脂糖凝膠電泳法、液相色譜法和毛細管凝膠電泳法,并對未來質粒DNA構型分離和分析方法的發(fā)展提出了展望。引言質粒DNA是染色體(或擬核)外穩(wěn)定存在的遺傳物質,具有自主復制的能力,廣泛存在于細菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物體內。通常,來自細菌的質粒是雙鏈、共價閉合的環(huán)狀DNA分子,以超螺旋(SC)構型存在。在提取、純化和保存過程中,細菌質粒會發(fā)生降解,單鏈斷裂會使SC構型轉變成開環(huán)(OC)構型,雙鏈斷裂會變成線性(L)構型。在3種構型中,SC構型的質粒最穩(wěn)定,且在細胞中的轉化和表達效率也最高。細菌質粒是基因工程中最常用的載體。它能攜帶目的基因進入受體細胞中,并促使目的基因在受體細胞中表達。目前,質粒已經成為DNA疫苗開發(fā)的一種流行的基因傳遞載體,用于癌癥、過敏、自身免疫和傳染病的治療。與常規(guī)的蛋白或者肽疫苗相比,DNA疫苗更穩(wěn)定、成本更低、制造更簡單且安全性更高。迄今為止,在美國登記的DNA疫苗臨床試驗項目已經超過500項,主要針對病毒感染和癌癥。此外,質粒還被用作基因治療中腺相關病毒載體和CAR-T細胞治療中慢病毒載體的構建。近來,質粒還被作為非病毒基因傳遞系統的一部分,用于表皮生長因子受體特異性CAR-T細胞的產生。作為基因治療和細胞治療的關鍵原材料,質粒產品的質量至關重要。各國監(jiān)管機構紛紛出臺相應的規(guī)定,對質粒產品的純度、安全性和有效性等做了嚴格的要求。其中,SC構型質粒比例是衡量產品質量的重要指標,但由于其構型的多樣性和復雜性,使得分離和分析較為困難。本文就瓊脂糖凝膠電泳法、液相色譜法和毛細管凝膠電泳法在質粒構型分離和分析中的研究進展進行了評述,并對未來質粒構型分離和分析方法的發(fā)展提出了展望。正文部分1

瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳(AgaroseGelElectrophoresis,AGE)是DNA分析的常用技術之一,具有操作簡單、快速和分離范圍廣等優(yōu)點,被廣泛應用于基礎理論研究、農業(yè)科學、醫(yī)學衛(wèi)生和工業(yè)生產等許多領域。AGE法采用瓊脂糖作為電泳支持介質,分析原理基于電泳和分子篩雙重作用。DNA在電泳的過程中帶負電荷,在電場的作用下由負極向正極遷移。不同大小和構型的DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同,從而達到分離的目的。2

液相色譜法液相色譜法(LiquidChromatography,LC)是根據待測樣品中的各組份在固-液兩相之間分配行為的差異而進行分離的方法。根據分離模式不同,用于質粒DNA構型分離和分析的LC方法包括陰離子交換色譜法、親和色譜法、疏水作用色譜法和多峰色譜法等。2.1

陰離子交換色譜法與OC構型和L構型質粒相比,SC構型質粒的結構更緊密,電荷密度更高。利用它們的電荷密度差異,可以使用陰離子交換色譜法(AnionExchangeChromatography,AEC)來分離和分析質粒的構型。但是在不同的離子交換色譜柱中3種構型的質粒出峰順序并不一致,且分離性能也不盡相同。2.2

親和色譜法親和色譜法(AffinityChromatography,AC)是基于目標生物分子與載體上特定配體的可逆相互作用來分離和分析生物分子的色譜方法。配體和目標生物分子之間的相互作用包括靜電作用、疏水作用、氫鍵、范德華力、配位鍵和弱共價鍵等,可利用競爭性配體進行特異性洗脫,也可采用改變pH值、離子強度和極性等非特異性洗脫方式進行洗脫。AC法具有選擇性高、特異性好和分辨率高等優(yōu)勢,在質粒純化和分析中深受研究者的青睞。2.3

疏水作用色譜法作為質粒純化和構型分離的工具,疏水作用色譜(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)受到了極大的關注。HIC中質粒DNA的分離依賴于通過疏水載體的流動相緩沖液中的鹽濃度,高濃度的鹽能增強質粒DNA與疏水載體的相互作用,反之亦然。HIC分離包括4步:平衡、樣品應用、洗脫和再生。平衡步驟是通過含有鹽的緩沖液來制備用于分離的固定相;樣品應用步驟將樣品引入固定相,并通過中等濃度的鹽洗滌弱結合的物質;洗脫階段通過梯度降低鹽濃度來分離質粒DNA的異構體;最后一步是固定相的再生,除去所有強作用的分子。HIC的條件溫和,具有極好的回收率。2.4

多峰色譜法多峰色譜(MultimodalChromatography,MMC),又叫混合模式色譜,是近年來興起的一種具有潛力的色譜方法。該方法在固定相載體上修飾具有多個活性位點的配體,這種配體在相同條件下可以表現出多種相互作用,利用該優(yōu)勢可以實現質粒DNA異構體的分離和分析。3

毛細管凝膠電泳法毛細管凝膠電泳(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)是毛細管電泳的一種分離模式,主要適用于蛋白質、核酸等生物大分子的分離,具有高效、微量、靈敏及自動化等特點。3.1

CGE分離介質CGE分離介質主要包括化學膠和物理膠兩大類?;瘜W膠是指交聯或化學鍵合到毛細管壁上粘度較高的凝膠,物理膠則指不交聯或鍵合到管壁上粘度較低的高分子溶液。3.2

CGE分離通道毛細管是CGE的分離通道,毛細管壁的性質直接影響質粒DNA不同構型的分離效果。對于非涂層毛細管來說,電滲流是最大的驅動力來源之一。電滲流情況的存在,能夠有效增加分離的速度,但是也減少了分離的時間和分離的有效距離,電滲流的波動也極大影響了遷移時間的重復性。許多研究工作采用未涂層的毛細管來分離質粒DNA異構體,通過優(yōu)化一些實驗參數,如緩沖溶液的濃度、酸堿度、篩分聚合物的濃度和聚合物分子長度等條件,來減少電滲流對質粒DNA異構體分離效果的影響,但是效果往往不佳。3.3

CGE檢測模式毛細管電泳中應用最多的檢測器是紫外(UV)檢測器,其次是熒光檢測器。激光誘導熒光(LIF)檢測器是熒光檢測器的一種,它采用激光作為激發(fā)源,具有極窄的帶寬、高空間相干性和可忽略的色差,很容易聚焦到毛細管的微通道上。自從Gassmann等首次將LIF檢測器引入到毛細管電泳以來,毛細管電泳的靈敏度和特異性得到了顯著的提高。4

展望展望質粒DNA構型的分離和分析,對于質粒DNA的純化、質量評估以及穩(wěn)定性監(jiān)測等具有重要意義。AGE作為最早應用于質粒DNA構型分離和分析的技術,具有操作簡單、快速和分離范圍廣等優(yōu)點。然而,靈敏度低和重復性差限制了其在治療用質粒DNA分離和分析中的應用。液相色譜中,AEC仍然是質粒DNA異構體分離和分析的主要手段。AC具有較高的選擇性、特異性和分辨率等優(yōu)勢,在質粒純化和分析中受到了研究者廣泛的關注。近年來發(fā)展起來的MMC允許在單個色譜程序中同時與樣品進行一次以上的相互作用,成為非常有潛力的質粒分

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