科研立項計劃書

PAGEPAGE4項目編號附件2：北京林業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃創(chuàng)新訓練項目申請書項目名稱：栓皮櫟組培再生體系的構建及原生質體游離研究主持人：宋少宇專業(yè)年級生科10聯(lián)系電話導教師：王君職稱副教授學院生物科學與技術學院起止年月：2012年1月—2013年12月申請日期：2012年4月20日北京林業(yè)大學

一、項目基本情況項目簡介項目名稱栓皮櫟組培再生體系的構建及原生質體游離研究項目類別√理工農類□經管文法類申請經費（元）30000起止年月2012年1月——2013年12月主持人姓名性別學號專業(yè)年級聯(lián)系電話電子郵箱宋少宇女100414217生科1015201443936angela-song@項目組其他成員姓名性別學號專業(yè)年級所在學院項目分工李昌磊男100414203生技10-2生物科學與技術學院組培再生體系研究曾青青女100414226生科10生物科學與技術學院組培再生體系研究郭倩女100114118林學10-1林學院原生質體游離研究尚峰男男100414204生科10生物科學與技術學院原生質體游離研究指導教師姓名性別年齡職稱職務所在學院王君男30副教授生物科學與技術學院研究方向林木倍性育種及細胞遺傳學聯(lián)系電子郵箱wangjun@三、項目研究內容（一）項目研究內容（限600字）1、栓皮櫟愈傷組織的誘導和繼代研究分別以栓皮櫟無菌莖段、葉片和葉柄為材料，對愈傷組織誘導培養(yǎng)基的外源生長調節(jié)劑種類及配比進行篩選，誘導產生愈傷組織，并篩選適宜的愈傷組織繼代培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。2、栓皮櫟愈傷分化及植株再生研究以栓皮櫟愈傷組織為材料，篩選愈傷組織分化出芽的適宜培養(yǎng)基及其外源生長調節(jié)劑配比，并進一步開展生根適宜培養(yǎng)基的篩選，建立栓皮櫟植株組培再生技術體系。3、栓皮櫟葉肉和愈傷組織原生質體游離研究以栓皮櫟無菌苗葉片和愈傷組織為材料，開展栓皮櫟葉肉原生質體和愈傷組織原生質體游離的適宜預處理條件、酶種組合和適宜濃度、等滲劑濃度及酶解時間等相關技術條件研究，建立較為完善的栓皮櫟原生質體游離技術體系。（二）項目研究擬解決的關鍵問題（限300字）栓皮櫟植株組培再生技術櫟樹無性繁殖困難，主要采用種子園技術生產良種，難以同時利用對優(yōu)良個體的加性和非加性效應，本研究通過建立栓皮櫟無菌體系和植株再生系統(tǒng)，解決無性繁殖技術關鍵問題的同時，為進一步開展體胚發(fā)生和基因工程育種研究奠定基礎。栓皮櫟葉肉及愈傷組織原生質體游離技術利用原生質體可以進行細胞融合和體細胞雜交，是一種創(chuàng)造遠源雜種，獲得同源或異源三倍體、四倍體以及雙二倍體的新途徑。本研究解決栓皮櫟原生質體游離關鍵技術，建立栓皮櫟原生質體游離技術體系，為進一步開展原生質體培養(yǎng)，實現細胞工程育種突破奠定基礎。四、項目實施方案（一）項目研究擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案（限1000字）1、研究方案和技術路線本項目以栓皮櫟無菌莖段、葉片、葉柄等為材料，誘導產生愈傷組織，并通過篩選培養(yǎng)基誘導愈傷組織分化為芽和根，構建再生體系；在此基礎之上，以無菌苗葉片和愈傷組織為材料，探索原生質體游離條件，形成較為完善的栓皮櫟原生質體游離技術體系。技術路線如下：愈傷組織繼代適宜培養(yǎng)基篩選愈傷組織繼代適宜培養(yǎng)基篩選愈傷組織分化出芽培養(yǎng)基篩選生根培養(yǎng)基篩選栓皮櫟植株再生體系建立栓皮櫟莖段外植體無菌體系消毒、滅菌、接種無菌莖段、葉片、葉柄無菌葉片和愈傷組織愈傷組織誘導適宜培養(yǎng)基篩選適宜預處理技術研究適宜酶種及濃度篩選適宜等滲劑濃度篩選適宜酶解時間研究栓皮櫟原生質體游離技術體系2、研究方法（1）栓皮櫟外植體的接種和繼代培養(yǎng)采集栓皮櫟枝條水培，抽條后，切取含腋芽的幼嫩莖段做為外植體，依次經滴露表面消毒5min，自來水沖洗30min，70%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，0.1%HgCl2浸泡處理2min，無菌水沖洗3次的消毒過程后接入MS(Murashige和skoog，1962）附帶6-BA0.2mg/L的初始培養(yǎng)基。接種后每20至30天轉接一次，繼代培養(yǎng)基為MS附帶6-BA0.6mg/L，擴大無菌材料數量。（2）栓皮櫟愈傷組織的誘導采用正交試驗設計，分別以栓皮櫟無菌莖段、葉片和葉柄為材料，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)基適宜激素種類及配比的篩選，以MS作為基本培養(yǎng)基，篩選因素包括細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度及配比，L9（34）正交試驗設計表如下：表2愈傷組織誘導培養(yǎng)基激素組合及濃度水平ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)2，4-D(mg·L-1)TDZ(mg·L-1)100000.131.00.51.00.5（3）栓皮櫟愈傷組織分化及植株再生以栓皮櫟愈傷組織為材料，采用L9（34）正交實驗設計，以MS為基本培養(yǎng)基對愈傷組織分化為芽的培養(yǎng)激素配比進行篩選，試驗設計如下：表3愈傷組織分化培養(yǎng)基激素篩選試驗設計表ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)2,4-D(mg·L-1)TDZ(mg·L-1)100000.531.01.01.01.0將愈傷組織分化形成的芽轉移到生根培養(yǎng)基中，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對生根培養(yǎng)基激素配比進行篩選，設計如下：表4生根培養(yǎng)基激素篩選試驗設計表ElementLevel6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)10020.10.530.51.041.01.5（4）栓皮櫟葉肉和愈傷組織原生質體的游離分別以栓皮櫟無菌苗葉片和愈傷組織為材料，以正交實驗設計結合單因素實驗設計，采用酶解法，研究酶的種類與濃度、滲透壓穩(wěn)定劑濃度、酶解時間、預處理方法等因素對原生質體分離效果的影響。將葉片或愈傷組織切成0.5mm的細條或者碎塊，按照1:10的比例置于經抽濾滅菌的含纖維素酶R-10、半纖維素酶、果膠酶Y-23和離析酶R-10的混合酶液中，在一定的溫度下、慢速往復式搖床上黑暗酶解。酶液為CPW鹽溶液加一定濃度的甘露醇，并附加MES0.6g/L、BSA1g/L，pH為5.7。酶解產物分別經200目和400目不銹鋼濾網依次過濾，以除去未酶解完全的細胞團或組織，500r/min離心2.5min收集，新鮮洗液洗滌3次，收集原生質體。表5原生質體分離酶種及濃度篩選L9(34)正交實驗設計表ElementLevelCellulaseR-10HemicellulasePectinaseY-23MacerozymeR-101000021.5%0.25%0.25%0.5%33%0.5%0.5%1.0%（5）原生質體的產量與活力測定用血球計數板統(tǒng)計原生質體產量，每個樣品計數重復5次，取平均值，最后計算原生質體產量。原生質體數（個/mL）=5個大格內原生質體總數×5×10000×稀釋倍數；原生質體產量（個/g）=[原生質體數（個/mL）×稀釋后體積（mL）]/葉片總質量（g）；原生質體產量遵從泊松分布，應該對獲得的原生質體產量試驗數據進行平方根轉換后，應用MicrosoftExcel軟件進行統(tǒng)計分析。原生質體活力測定用0.01%二乙酸熒光素（FDA）染色。每個樣品觀測5次取平均值，統(tǒng)計原生質體活力。原生質體活力=(發(fā)綠色熒光的原生質體數/原生質體總數)×100%。（6）數據處理主要采用方差分析對數據處理進行處理，其中涉及百分率的數據在方差處理前進行反正弦平方根轉換。（二）項目實施年度計劃二〇一二年①2012年1～4月，采集栓皮櫟外植體，接種獲得無菌苗；②2012年5～10月，栓皮櫟愈傷組織誘導研究；③2012年11～12月，數據整理。二〇一三年①2013年1～4月，栓皮櫟葉肉原生質體的游離技術研究；②2013年2～7月，栓皮櫟愈傷組織分化及植株再生研究；③2013年6～10月，栓皮櫟愈傷組織原生質體游離技術研究；④2013年11～12月，整理試驗結果，撰寫研究論文和總結報告。二〇一四年五、項目研究基礎（一）與本項目有關的研究積累和已取得的成績（限300字）本項目申請者及項目組成員均為生物學院生物科學和生物技術專業(yè)10級學生，已主修了《植物學》、《植物組織培養(yǎng)》等相關專業(yè)基礎課程，通過查閱文獻資料進一步學習，對植物生物技術研究有了較為全面的認識，且項目組成員已開展植物組織培養(yǎng)相關研究較長時間，較為熟練的掌握了基本操作技能。指導教師及其課題組長期從事林木遺傳改良研究，在新疆楊等楊屬樹種中已系統(tǒng)開展組織培養(yǎng)及原生質體游離與純化方面研究，發(fā)表學術論文一篇，具有豐富的研究經驗和知識儲備。該項目前期試驗已有所開展，已通過接種栓皮櫟外植體獲得了無菌材料，為本項目的進一步實施奠定了基礎。目前正在進一步擴繁栓皮櫟莖段。（二）已具備的研究條件、設備條件等（限200字）本項目依托北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室和林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，相關試驗主要在北京林業(yè)大學分析測試中心生物技術室開展，實驗室有關植物組織培養(yǎng)、原生質體游離、顯微觀察等試驗條件和設備較為完善，可基本滿足項目研究需求。（三）尚缺少的條件及解決方法（限200字）本項目試驗條件尚缺少1000μL和200μL微量移液器各1把用于培養(yǎng)基的配制和原生質體的游離、國產大容量低速離心機1臺用于原生質體的收集，擬通過購置的方式解決。六、項目特色、創(chuàng)新點及預期成果（一）項目的特色與創(chuàng)新點（限300字）1、研究思路科學：本項目基于栓皮櫟無菌再生體系研究，分別利用研究過程中獲得的無菌葉片和愈傷組織開展原生質體游離技術探索，步步深入，思路科學。2、研究材料重要：栓皮櫟木材堅硬，抗腐蝕性強，是重要的硬闊用材和軟木資源樹種；其分布廣泛、適應性強，在維持地域生態(tài)平衡和生態(tài)系統(tǒng)恢復等方面具有作用巨大。3、研究方法新穎：植物原生質體為植物育種和遺傳工程研究提供了理想的遺傳操作實驗系統(tǒng)。本項目在國內首次開展櫟樹原生質體游離技術研究，有望從細胞工程途徑突破櫟樹遺傳改良研究進展。4、理論聯(lián)系實際：栓皮櫟無性繁殖困難，遺傳改良程度低，本項目的實施有望從組培快繁途徑實現無性繁殖，并為進一步開展細胞工程育種奠定基礎。（二）項目預期成果及成果提交方式（限300字）構建并優(yōu)化栓皮櫟組培再生體系；建立較為完善的栓皮櫟原生質體游離技術體系；提交北京林業(yè)大學國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目結題報告；發(fā)表中文核心期刊論文1篇；申請國家發(fā)明專利1項；熟練掌握植物組織培養(yǎng)及原生質體分離實驗技能，提高個人獨立設計并完成試驗的能力，以及共同面對問題、解決問題的團隊合作精神。七、項目經費預算支出科目預算金額（元）預算編制依據主要用途合計30000.001.材料費18100①纖維素酶20g，單價70元/g，總價1400元；②果膠酶10g，單價900元/g，總價9000元；③半纖維素酶10g，單價340元/g，總價3400元；④離析酶10g，單價80元/g，總價800元；⑤甘露醇等穩(wěn)定劑2100元；⑥配制培養(yǎng)基所需的基本物質等試劑和離心管、槍頭、培養(yǎng)皿等耗材共1400元。用于購置原生質體游離所需酶類、穩(wěn)定劑，配制培養(yǎng)基所需的基本物質等試劑，以及離心管、槍頭、培養(yǎng)皿等耗材2.設備費（1）購置設備費2900.00微量移液器2把，單價1450元/把，合計1450×2=2900元購置微量移液器2把（2）試制設備費（3）改造設備費（4）設備租賃費3.測試化驗加工費4.出版/文獻/信息傳播/知識產權事務費5000.00①中文核心期刊論文1篇，版面費約2000元；②國家發(fā)明專利申請代理費用2500元；③文獻資料的檢索、復印、報告印制等費用約500元用于文獻資料的檢索和論文發(fā)表版面費5.差旅費4000.00①采集櫟樹試驗材料的來回差旅費約1500元/人，2人共300