G-CSF動員對供者T淋巴細(xì)胞亞群功能和急性移植物抗宿主病的影響

1/1G-CSF動員對供者T淋巴細(xì)胞亞群功能和急性移植物抗宿主病的影響G-CSF動員對供者T淋巴細(xì)胞亞群功能和急性移植物抗宿主病的影響作者：

劉慶國，楊棟林，黃勇，姜爾烈，周世勇，何依，王志東，王玫【摘要】為了研究粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動員對供者T淋巴細(xì)胞亞群功能和急性移植物抗宿主?。╝GVHD）的影響，對20例供者G-CSF動員前后的外周血樣品，加入佛波醇酯、伊能霉素、莫能霉素體外刺激培養(yǎng)4小時，以3色熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群Ⅰ（分泌INF-、INF-）、Ⅱ型（分泌IL-4、IL-5和IL-10）細(xì)胞比例。

結(jié)果表明：

G-CSF動員前外周血CD3+IFN-+、CD4+IFN-+和CD8+IFN-+T細(xì)胞的比例分別為3.2%(0%-45.9%)、1.3%(0%-23.8%)和1.5%(0%-22.2%)，G-CSF動員后前述細(xì)胞比例顯著升高，分別為19.2%(0%-53.9%)、9.5%(0%-49.5%)和7.5%(0%-38.1%)。

動員前CD3+IL-2+、CD4+IL-2+、CD8+IL-2+T細(xì)胞比例分別為1.5%(0%-31%)、0.8%(0%-30.0%)和0%(0%-5.3%)，動員后比例亦明顯升高，分別為25.7%(0%-51%)、19.8%(0%-39.7%)、4.6%(0%-20.9%)。

T細(xì)胞各亞群的IL-4陽性細(xì)胞比例在動員后升高不明顯。

移植早期aGVHD發(fā)生組供者的Tc1細(xì)胞比例顯著高于無aGVHD組。

動員后高Tc2比例組，其受者中、重度aGVHD的發(fā)生率明顯低于低Tc2比例組（分別為20.0%和77.8%）。

結(jié)論：

G-CSF動員使供者外周血的I型T細(xì)胞比例增加，動員后高Tc1細(xì)胞比例與移植早期aGVHD發(fā)生相關(guān)，Tc2比例與中重度aGVHD發(fā)生率負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】G-CSF動員；T淋巴細(xì)胞亞群；移植物抗宿主病InfluenceofG-CSFMobilizationonFunctionsofDonorTLymphocyteSubpopulationandAcuteGraft-versus-HostDiseaseAbstractToinvestigatetheinfluenceofG-CSFmobilizationonfunctionsofdonorTlymphocytesubpopulationandacutegraft-versus-hostdisease，peripheralbloodsamplesof20healthydonorswerecollectedbeforeandafterG-CSFmobilization.ThewholebloodwasdilutedwithIMDMinratioof1∶1andthenincubatedwithPMA+ionomycin+monensinat37℃，5%CO2for4hours.Afterbeingmoblizedandstained，theIL-4，IFN-andIL-2positivecellswerecountedwiththree-colorflowcytometry.TheresultsshowedthatbeforeG-CSFmobilization，thepercentagesofdonorsCD3+IFN-+，CD4+IFN-+，CD8+IFN-+Tcellswere3.2%(0%-45.9%)，1.3%(0%-23.8%)and1.5%(0%-22.2%)respectively.Thepercentageofabovementionedcellsindonorincreasedto19.2%(0%-53.9%)，9.5%(0%-49.5%)，7.5%(0%-38.1%)respectivelyafterG-CSFmobilization.TheIL-2positiveCD3+，CD4+andCD8+Tcellpercentageinpre-G-CSFmobilizeddonorswas1.5%(0%-31%)，0.8%(0%-30.0%)and0%(0%-5.3%)respectivelyandsubsequentlyincreasedto25.7%(0%-51%)，19.8%(0%-39.7%)，4.6%(0%-20.9%)respectivelyafterG-CSFmobilization.TheIL-4positiveTsubpopulationdidnotincreasedsignificantlyafterG-CSFmobilization.Intheearlystageafterperipheralbloodstemcelltransplantation，donorsTc1percentageinaGVHDgroupwassignificantlyhigherthanthatinnon-aGVHDgroup.ThemorbidityofsevereaGVHDinhighTc2percentagegroupwassignificantlylowerthanthatinlowTc2percentagegroup.ItisconcludedthatthedonorstypeITcellsincreaseafterG-CSFmobilization，theTc1percentageofG-CSFmobilizeddonoriscorrelatedwiththeoccurrenceofaGVHDintheearlystageafterHSCT，thepercentageofTc2indonorisnegativelycorrelatedwithaGVHDmorbidityinrecipients.KeywordsG-CSFmobilization；Tlymphocytesubpopulation；acutegraft-versus-host-disease急性移植物抗宿主?。╝GVHD）是異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)的常見并發(fā)癥，aGVHD的發(fā)生率高達(dá)30%-80%，發(fā)生aGVHD者因直接和間接原因而死亡的發(fā)生率可達(dá)50%［1］。

aGVHD主要由T細(xì)胞介導(dǎo)，這個病理過程起始于移植物中供者T細(xì)胞與受者抗原相遇，隨后供者T細(xì)胞識別受者抗原發(fā)生克隆性擴(kuò)增，其不僅直接通過細(xì)胞毒作用對組織細(xì)胞進(jìn)行攻擊，并通過分泌細(xì)胞因子間接造成組織損傷。

根據(jù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，T淋巴細(xì)胞被分類為Ⅰ型和Ⅱ型T細(xì)胞。

分泌IFN-、TNF-的CD4+T細(xì)胞（Th1）和CD8+T細(xì)胞（Tc1）被認(rèn)為是Ⅰ型T細(xì)胞，其在免疫應(yīng)答過程中誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和遲發(fā)型免疫反應(yīng)，在抗病毒和清除細(xì)胞內(nèi)抗原方面發(fā)揮作用。

分泌IL-4、IL-5和IL-10的CD4+T細(xì)胞（Th2）和CD8+T細(xì)胞（Tc2）被認(rèn)為是Ⅱ型T細(xì)胞，其主要通過促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE和募集嗜酸、嗜堿粒細(xì)胞誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，在清除細(xì)胞外抗原方面發(fā)揮作用［2］。

T細(xì)胞群的細(xì)胞因子譜可因刺激和所處微環(huán)境不同而轉(zhuǎn)換為Ⅰ型或Ⅱ型免疫應(yīng)答。

在人類和小鼠的免疫系統(tǒng)中，Ⅱ型細(xì)胞因子能抑制T細(xì)胞增殖和Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

由Th2分泌的IL-4具有抑制Tc1合成IL-2的作用，并能下調(diào)I型細(xì)胞的因子合成、細(xì)胞增殖和長期細(xì)胞毒性。

雖然Tc1和Tc2細(xì)胞都具有細(xì)胞毒作用，但Tc2的細(xì)胞毒作用相對較弱。

與Tc1分泌高水平IFN-并促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育相反，Tc2分泌IL-4不僅對Th2細(xì)胞起促進(jìn)作用并能抑制Th1細(xì)胞發(fā)育。

因此，Ⅰ型和Ⅱ型T細(xì)胞相互調(diào)節(jié)，兩者之間的平衡決定著細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)的特征。

在造血干細(xì)胞移植中，絕大多數(shù)受者的aGVHD發(fā)生于T細(xì)胞免疫重建后，而由于放、化療預(yù)處理及皮質(zhì)激素應(yīng)用導(dǎo)致了胸腺功能異常［3］，T細(xì)胞免疫重建有賴于移植物中成熟T細(xì)胞擴(kuò)增［4］。

因此，供者T細(xì)胞的免疫功能特征影響著受者移植后免疫。

異基因外周血干細(xì)胞移植（allo-PBSCT）的移植物中含有比骨髓移植物高10-20倍的T細(xì)胞，但aGVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重度并無明顯增加，而慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）的發(fā)生率顯著增高，提示供者T細(xì)胞功能在G-CSF動員后具有獨(dú)特的特征。

在本研究中，我們應(yīng)用佛波醇酯（PMA）+伊能霉素（ionomycin)和莫能霉素(monensin)刺激培養(yǎng)G-CSF動員前、后供者外周血標(biāo)本，用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群的Ⅰ、Ⅱ型細(xì)胞比例的變化，探討供者T細(xì)胞亞群Ⅰ、Ⅱ型細(xì)胞的比例與aGVHD的相關(guān)性，以期有助于了解aGVHD的發(fā)生機(jī)制。

材料和方法病例標(biāo)本取自2002年11月至2003年7月間在我院進(jìn)行allo-PBSCT的20例患者。

供者中位年齡46歲（21-63歲），其中女13例，男7例；受者中位年齡31歲（14-46歲），其中女4例，男16例。

患者疾病類型包括急性淋巴細(xì)胞白血病5例（第1次完全緩解期2例，第2次完全緩解期2例，部分緩解1例），急性粒細(xì)胞白血病第1次完全緩解期4例，慢性粒細(xì)胞白血病10例（慢性期7例，加速期2例，急性變1例），重型再生障礙性貧血1例。

供者外周血干細(xì)胞動員采用惠爾血（日本麒麟公司）5g/kg皮下注射，1日2次，于第5和第6天采集干細(xì)胞。

患者預(yù)處理采用單次全身照射（TBI）7Gy＋環(huán)磷酰胺（CY）60mg/kg2天＋阿糖胞苷1g/m2，12小時1次2天方案，或者馬利蘭（BU）4mg/(kgd）4天＋CY60mg/kg2天方案。

aGVHD預(yù)防采用FK5060.03mg/kg，或者FK506＋抗CD25單克隆抗體＋MTX聯(lián)用。

aGVHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)〖5］。

主要試劑CD8-PerCP（SK2克?。?、PerCP-isotype（X40克?。?、IL-2PE（5344.111克?。┵徸訠ectonDickinson公司，IL-4-PE（4S.B3克?。?、IFN--PE（4S.B3克?。?、PE-isotype（MouseIgG1）以及CD3-FITC（SK7克隆）購自BectonDickinson-法默金公司。

溶血素（BDFACSLysingSolution)、破膜劑（BDFACSPermeabilizingSolution2）均購自BectonDickinson公司。

PMA、伊能霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)購自Sigma公司。

IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清等購自GibcoBRL公司。

標(biāo)本采取用肝素抗凝管分別在供者外周血干細(xì)胞動員前、動員后收集外周血1ml。

細(xì)胞培養(yǎng)肝素抗凝全血1ml與IMDM1∶1在培養(yǎng)皿中混勻，并加入佛波醇酯(10ng/ml)和伊能霉素(500ng/ml)、莫能霉素(1.7g/ml)，37℃、5％CO2孵箱中孵育4小時。

細(xì)胞表面染色及胞內(nèi)染色將20lCD3-FITC和CD8-PerCP分別加入Falcon管中。

將培養(yǎng)4小時后的稀釋全血200l分別加入上述各Falcon管，渦旋混勻，室溫避光孵育15分鐘。

15分鐘后，各管中加入2-3ml1FACS溶血素混勻，室溫避光孵育10分鐘后500g離心5分鐘，棄上清。

分別加入1破膜劑(BDPermercia2)500l渦旋混勻，室溫避光孵育10分鐘。

完畢后加入2-3ml洗液（含2％熱滅活胎牛血清和0.1%疊氮鈉的PBS），離心500g5分鐘后棄上清。

在對照管中加入PE-isotype，檢測管中分別加入IL-4-PE、IFN--PE，室溫避光孵育30分鐘。

用洗液洗1遍，棄上清，以1％多聚甲醛懸浮細(xì)胞至500l待測。

流式細(xì)胞術(shù)檢測分析樣本在FACSCalibur流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，應(yīng)用CellQuest軟件進(jìn)行測定和分析。

首先在前向散射光（FSC）對側(cè)向散射光（SSC）的點(diǎn)圖內(nèi)設(shè)門（gating），淋巴細(xì)胞群作為門1（G1），門內(nèi)收集10000淋巴細(xì)胞。

以G1為基礎(chǔ)在CD3和SSC的點(diǎn)圖內(nèi)圈定CD3+淋巴細(xì)胞群作為門2（G2）。

分析G1內(nèi)CD3+細(xì)胞群的細(xì)胞因子（IL-4、IFN-、IL-2）陽性細(xì)胞比例，并分析G2內(nèi)CD3+細(xì)胞群中CD8+和CD8-細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞比例，以IFN-陽性和IL-4陽性分別代表Ⅰ、Ⅱ型T細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

檢測結(jié)果以中位數(shù)（最小值-最大值）表示。

動員前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)以及卡方檢驗(yàn)。

結(jié)果供者Ⅰ型、Ⅱ型T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞比例在動員前后的變化檢測20例供者動員前后T淋巴細(xì)胞亞群的INF-和IL-4陽性細(xì)胞比例，并進(jìn)行動員前后比較。

結(jié)果顯示，供者INF-陽性CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例在G-CSF動員后顯著升高，而IL-4陽性CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞比例升高不顯著。

檢測了14例供者IL-2陽性T淋巴細(xì)胞亞群比例，各亞群的IL-2陽性細(xì)胞比例在動員后均明顯升高（附表）。

Table.ChangesofdonorstypeⅠandⅡratiosofTlymphocytesubpopulationcellsbeforeandaftermobilization（略）G-CSF動員對不同HLA等位基因供者的影響11例供者表達(dá)HLA等位基因A1、A3、A24、B44、B60、DR15、DR17（陽性基因）。

這些供者動員后的CD3+IFN-+T細(xì)胞比例為33.8%(0.3%-53.9%)，明顯高于動員前的比例3.5%(0%-45.9%)（P=0.01）。

未表達(dá)前述HLA等位基因（陰性基因）的9例供者動員后CD3+IFN-+T細(xì)胞比例〖14.0%(0%-38.6%)］與動員前比例〖2.7%(0%-28.5%)］相比無明顯差異（P=0.137）（圖1）。

aGVHD組和無aGVHD組的供者T淋巴細(xì)胞亞群Ⅰ、Ⅱ型細(xì)胞比例比較去除移植后早期死亡的1例患者，有12例患者在移植后1月內(nèi)發(fā)生aGVHD，與另7例無aGVHD者相比，兩組供者的T淋巴細(xì)胞亞群Ⅰ、Ⅱ型細(xì)胞比例與動員前無明顯差異，而動員后aGVHD組的Tc1細(xì)胞比例顯著升高，Tc1在aGVHD組和無aGVHD組的比例分別為10.2%(0.3%-38.1%)vs1.1%(0.0%-16.0%)(P=0.042)（圖2）。

高Tc2細(xì)胞比例與中重度aGVHD的相關(guān)性以上述19例供者動員后中位Tc2比例值（1.9%）為界，Tc2比例1.9%者有10例，＜1.9%者有9例，移植后前者僅有2例發(fā)生中重度aGVHD（20.0%），而后者有7例(77.8%)發(fā)生中重度aGVHD(P=0.019)，結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。

討論早期研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF能增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)［6］。

應(yīng)用RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF動員后癌癥患者外周血單個核細(xì)胞(G-PBMNC)持續(xù)高表達(dá)IL-2、4、10、IFN-和TNF-［7］。

近年來的研究顯示，與正常人的PBMNC相比，從G-CSF動員后癌癥患者PBMNC中純化的CD4+、CD8+T細(xì)胞的IL-2、4、10和IFN-的mRNA水平增加［8］。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白水平表達(dá)，發(fā)現(xiàn)G-CSF動員后IL-2、IFN-陽性細(xì)胞比例顯著增加，與動員前相比，動員后IL-4陽性細(xì)胞比例雖有增加但差異不顯著。

G-CSF對淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用的確切機(jī)制目前尚不清楚。

早期觀點(diǎn)認(rèn)為，淋巴細(xì)胞沒有G-CSF受體，因而推測可能是通過間接調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用。

Sloand等［9］用RT-PCR方法在G-CSF刺激培養(yǎng)后的純化淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)G-CSF受體mRNA表達(dá)，提示G-CSF可能直接作用于淋巴細(xì)胞，但是其確切作用機(jī)制至今尚未明確闡述。

另外，在Joshi等［10］的研究中，動員后供者T細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)或者減弱與自身的HLA等位基因有關(guān)，攜帶HLA-A1、A3、A24、B44、B60、DR15、DR17等位基因的供者，動員后T細(xì)胞分泌I型細(xì)胞因子TNF-和IL-1的能力增強(qiáng)。

其研究與目前認(rèn)為HLA相合同胞移植中HLA-A3等位基因與高aGVHD危險(xiǎn)相關(guān)的觀點(diǎn)部分相符［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)前述HLA等位基因的供者在動員后IFN-陽性T細(xì)胞比例亦明顯增加，因此G-CSF動員后細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)的機(jī)制較為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步研究。

G-CSF動員后淋巴細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，但臨床上并未發(fā)現(xiàn)外周血干細(xì)胞移植比骨髓移植有更高的aGVHD發(fā)生率。

研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF動員后的干細(xì)胞采集物（G-PBSC）中含有比標(biāo)準(zhǔn)骨髓采集物中高約50倍以上的單核細(xì)胞及其祖細(xì)胞［12］，動員后的單核細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型極化，從而抑制T細(xì)胞的功能。

另外，新近研究發(fā)現(xiàn)，G-PBSC中含有較多的低密度粒細(xì)胞（LDG），其能抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-和IL-4的功能，而去除LDG后T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力又會恢復(fù)［13］。

因此，G-PBSC中高比例單核細(xì)胞、LDG對T淋巴細(xì)胞功能的抑制可能是allo-PBSCT的aGVHD發(fā)生率不高于BMT的原因。

比較移植早期發(fā)生aGVHD組與無aGVHD組，aGVHD組的供者動員后Tc1（CD8+IFN-+）細(xì)胞比例顯著升高。

Tc1細(xì)胞不僅以細(xì)胞-細(xì)胞方式通過誘導(dǎo)穿孔素、端粒酶和Fas依賴的細(xì)胞毒作用直接導(dǎo)致靶細(xì)胞損傷，并通過分泌IFN-控制和增強(qiáng)對異體抗原的免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)CTL和NK細(xì)胞活化、預(yù)激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子IL-1和TNF-，從而促進(jìn)aGVHD發(fā)生［14］。

而Tc2（CD8+IL-4+）細(xì)胞可以通過否決CTL前體細(xì)胞方式抑制細(xì)胞免疫［15］，在動物骨髓移植模型中還發(fā)現(xiàn)Tc2細(xì)胞對于減輕aGVHD的嚴(yán)重程度有重要作用［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，供者動員后高Tc2比例組的中重度aGVHD的發(fā)生率低于低Tc2比例組。

通過對G-CSF動員后供者Tc1、Tc2細(xì)胞比例的檢測，有助于對aGVHD發(fā)生危險(xiǎn)性進(jìn)行預(yù)測，對于高aGVHD風(fēng)險(xiǎn)患者加強(qiáng)免疫抑制藥物預(yù)防有指導(dǎo)意義。

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